Контрольные вопросы

1. Что такое денитрификация? Раскройте сущность процесса.

2. Какую питательную среду нужно взять для изучения процесса денитрификации?

3. Как сделать препарат из приготовленного субстрата?

4. Каких возбудителей можно обнаружить под микроскопом?

5. При­ведите примеры процессов, при которых азот переходит в соединения, не­доступные для растений.

Лабораторная работа №10 Изучение свободноживущих азотфиксирующих бактерий

Цель работы: изучить азотфиксирующие клостридии (Clostridium pasteurianum).

Основная масса азота на Земле находится в газообразном со­стоянии и составляет свыше 3/4 атмосферы (78,09% по объему, или 75,6% по массе). Практически запас азота нашей планеты неисчер­паем - 3,8*10¹⁵ т N₂. Азот - довольно инертный элемент, поэтому редко встречается в связанном состоянии. Это один из основных биофильных элементов, необходимый компонент главных полиме­ров живых клеток - структурных белков, белков-ферментов, АТФ, нуклеиновых кислот. Никакой другой элемент так не лимитирует ресурсы питательных веществ в агросистемах, как азот. Он может стать доступным для живых организмов только в связанной форме, т. е. в результате азотфиксации.

Азотфиксация - биологический процесс, и единственными организмами, способными его осуществлять, являются прокариоты (эубактерии и архебактерии). Эти микроорганизмы частью само­стоятельно, а частью в симбиозе с высшими растениями превраща­ют молекулярный азот (N₂) в органические соединения и интегри­руют его (непосредственно или через растение) в белок, который в конце концов попадает в почву.

По способности вступать во взаимодействие с растениями микроорганизмы, осуществляющие фиксацию молекулярного азота, подразделяют на две группы - несимбиотические и симбиотические. В первой группе выделяют подгруппу свободноживущих азотфиксаторов, непосредственно не связанных с корнями высших растений, и подгруппу ассоциативных фиксаторов азота, обитающих в фитоплане — ризосфере (ризоплане) и филлосфере (филлоплане), т. е. на поверхности подземных и надземных органов растений, и находя­щихся с ними в синтрофных взаимоотношениях. К группе симбиотических азотфиксаторов относят микроорганизмы, развивающиеся в образованных на корнях или листьях клубеньках (или узелках) и находящиеся в симбиотических взаимоотношениях с растениями.

Впервые чистую культуру азотфиксаторов выделил С.Н. Виноградский в 1893 г. Это была анаэробная спорообразующая палочка - Clostridium pasteurianum. В 1901 г. гол­ландский микробиолог М. Бейеринк обнаружил аэробную бак­терию, также способную фиксировать молекулярный азот - Azotobacter chroococcum.

Фиксировать атмосферный азот могут самые различные микроорганизмы - бактерии, актиномицеты, а также многие цианобактерии (синезеленые водоросли).

Из анаэробных азотфиксаторов довольно хорошо изучены представители рода Clostridium, в частности С. pasteurianum. Молодые клетки клостридии имеют жгутики, старые образу­ют споры. При спорообразовании клетки утолщаются посере­дине или на одном конце. Встречаются представители рода как в кислых, так и в щелочных почвах. Клостридии способ­ны фиксировать до 10-12 мг азота на 1 г сброженного сахара. Свободноживущие азотфиксаторы вносят существенный вклад в азотный фонд почвы: они могут накапливать 25-95 кг/га азота.

Задание: Изучить свободноживущие азотфиксирующие бактерии (Clostridium pasteurianum).

Материалы и оборудование: Безазотистая питательная среда Виноградского, раствор йода в йодистом калии (1:2), почва, СаСО₃, мерные цилиндры на 100 мл, коническая колба на 100-150 мл, алю­миниевая чайная ложка или шпатель, пробирки; микро­скопы и все необходимое для микроскопирования и приго­товления препаратов в раздавленной капле.

Методика проведения работы

Для выявления анаэробных азотфиксаторов в почве ис­пользуют безазотистую среду Виноградского (в г на 1 л дистил­лированной воды): глюкоза - 20,0; К₂НРО₄ -1,0; MgSО₄ - 0,5; NaCl - 0,5.

В коническую колбу на 100-150 мл на ²/₃ объема налива­ют питательную среду и добавляют четверть чайной ложки мела (для нейтрализации масляной кислоты, образующейся при брожении). В среду вносят ¹/₃ чайной ложки почвы, кол­бу закрывают пробкой и ставят в термостат при 28- 30°С.

Через несколько дней поверхность жидкости покрывается пленкой аэробных бактерий, а на дне колбы начинается маслянокислое брожение, сопровождающееся выделением газа и масляной кислоты.

Клостридии обычно находятся в осадке мела и почвы. Для их обнаружения содержимое колбы перемешивают и да­ют осесть грубым частицам. Затем из середины субстрата пи­петкой берут немного жидкости и наносят каплю на пред­метное стекло. К ней добавляют каплю йода в йодистом калии (J:KJ=1:2), накрывают покровным стеклом и про­сматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Клетки клостридий содержат гранулезу (полисахарид, близ­кий к крахмалу), которая от раствора йода синеет. Преобла­дают клетки веретенообразной формы с овальными спорами.

Результаты опыта записывают, а возбу­дителей процесса азотфиксации зарисовывают.