Лабораторная работа №1 Углеводородокисляющие микроорганизмы, как естественная часть гетеротрофного бактериопланктона водных экосистем

Цель работы: определить количественный и качественный состав углеводородокисляющих микроорганизмов в воде морских (и/или пресных) водоёмов.

Большинство живых организмов в принципе способно к окислению углеводородов, что связано с наличием у них ферментов оксидаз. Функ­ции последних состоят в окислении кислородом воздуха восстановлен­ных соединений, образующихся в клетке, таких как НАДН, НАДФ и другие. Эти ферменты и осуществляемые ими реакции представляют собой участки дыхательной цепи, функционирующей в аэробных орга­низмах. Оксидазы могут распространять свое действие и на окисление СН₃-, СН₂- и СН-групп углеводородов. Поэтому незначительные ко­личества алифатических или ароматических углеводородов, попавшие в организм животных или человека, окисляются имеющимися в тканях оксидазами и выводятся. Однако основной вклад в процессы биохимического разрушения нефти вносят микроорганизмы, способные использовать углеводороды в качестве единственного источника угле­рода и энергии. Такие формы встречаются, в основном, среди аэробных микроорганизмов. Они получили название углеводородокисляющих. От других гетеротрофных микроорганизмов, многие из которых способны окислять углеводороды побочно, в небольших количествах и только в присутствии других органических соединений, углеводородокисляющие отличаются наличием не только комплекса ферментов, окисляющих углеводороды, но и системы поглощения гидрофобного субстрата. В первую очередь это связано с тем, что окисление углеводо­родов происходит внутриклеточно.

К окислению углеводородов способны как эвтрофные, так и олиготрофные бактерии, выделяемые из воды на обычных питательных средах, не содержащих углеводородов. Численность углеводородокисляющих бактерий в различных акваториях определяется теми же факторами среды, что и обычных гетеротрофных бактерий в целом — это климат (температура), наличие биогенных элементов, доступных источников углерода и другие факторы. Преимущество над остальными группами бактерий углеводородокисляющие получают при существенном загряз­нении среды углеводородами. Нефтяное загрязнение вносит дополнительный источник углерода в экосистему и численность углеводородокисляющих бактерий возрастает до тех пор, пока другие факторы не становятся лимитирующими. По этой причине численность углеводородокисляющих бактерий всегда выше в хронически загрязненных угле­водородами водах, чем в свободных от загрязнения районах.

Изучение численности углеводородокисляющих микроорганизмов является неотъемлемой задачей при исследовании деструкции нефти в водоеме или определении способности акватории к естественному самоочищению. Результаты определения численности углеводородокисляющих микроорганизмов зависят от используемых для этого методов.

К углеводородокисляющим бактериям относятся бактерии из родов Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Cytophaga, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Methanobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Pseudomonas, Vibrio, мицелиальные грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium, Trichoderma, дрожжи - Candida, Endomyces, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulopsis.

Задание:

• нарисовать схему посева для количественного определения углеводородокисляющих микроорганизмов;

• определить количество углеводородокисляющих микроорганизмов в 1 мл морской и/или пресной воде;

• выделить чистые культуры углеводородокисляющих микроорганизмов;

Материалы и оборудование: соли NaCl, MgSО₄x7Н₂О, КС1, К₂НРО₄, Na₂HPО₄, NH₄NО₃, K₂HPO₄, FeSO₄, (NH₄)₂SO₄, CaCO₃, агар, пробирки, стерильные градуированные пипетки на 1 мл; пинцеты, стерильные шпатели, микроскопы и все необходимое для приготовления окрашенных пре­паратов и микроскопирования.

Методика проведения работы:

1. Определение численности углеводородокисляющих микроорганизмов

Для учета углеводородокисляющих бактерий ис­пользуют среду ММС с дизельным топливом (г): NaCl - 7,0; MgSО₄x7Н₂О - 1,0; КС1 - 0,7; К₂НРО₄ - 2,0; Na₂HPО₄ - 3,0; NH₄NО₃ - 1,0; вода дистиллированная - 1,0 л. В качестве единственного источника углерода и энергии в среду для учета углеводородокисляющих бактерий добавляют дизельное топливо (летнее), а Источник углерода и энергии до­бавляют в количестве двух капель на пробирку с предварительно при­готовленными разведениями пробы воды. Предварительно дизтопливо или смесь ароматических соединений стерилизуют а автоклаве. Соленость среды при необходимости может быть понижена за счет уменьшения содержания в среде NaCl. Эту же среду можно использовать для учета углеводородокисляющих бактерий в пресных водоемах, исключив из ее состава NaCl.

Метод предельных разведений: Наиболее распространенным методом учета численности бактерий, способных к росту на питательных средах, является метод предельных разведений, который иногда называют методом наиболее вероятного чис­ле. Приготовленную жидкую питательную среду ММС с дизельным топливом разливают в пробирки с заранее подобранными ватными пробками по 9 мл в каждую. Среда обязательно должна быть прозрачной, если она мутная, то перед разливом в пробирки ее фильтруют. После разлива пробирки стерилизуют в автоклаве.

Непосредственно перед началом работы пробирки со средой устанавливают в штатив в 3 ряда (по числу повторностей), при этом в каждом ряду может быть от 3 до 6 пробирок. На пробирках надписывают номер разведения (крупная цифра) и справа снизу - индекс повторности (1₁, 1₂,...1₆ для первого ряда; 2_1; 2₂,...2₆ для второго ряда и 3_1; 3₂...3₆ для третьего ряда).

Для приготовления разведений 1 мл пробы воды отбирают сте­рильной пипеткой из склянки с пробой воды, переносят в пробирку с 9 мл среды, имеющую индекс 1. За­тем этой же пипеткой отбирают из склянки следующие 1 мл пробы воды и переносят в пробирку со средой, имеющую индекс 2 . Затем эту операцию повторяют для пробирки с индексом 3. Таким образом получают первое разведение пробы воды - 1:10.

Затем берут другую стерильную пипетку и с ее помощью тщатель­но перемешивают содержимое пробирки 1 набирая в нее содержимое пробирки и выпуская обратно и пробулькивая в пробирку из пипетки воздух. Это делается потому, что бактерии из первой взятой порции пробы воды адсорбируются на стенках пипетки, что может привести к недоучету их численности. Эту операцию повторяют не менее двух раз. Далее этой же пипеткой отбирают из пробирки 1 - 1 мл первого разведения пробы и переносят в пробирку с индексом 1. Таким образом, получают второе разведение - 1:100. Эти же манипуляции той же пипеткой повторяют с пробирками 2₁ и 3₁. Из них переносят уже разведенные в 10 раз пробы воды в пробирки с индексами 2₂ и 3₂ соответственно. Так же готовят и все последующие разведения, используя для приготовления каждого из них новую стерильную пипетку.

Время инкубации проб воды зависит от состава среды и исходной численности микроорганизмов в пробе воды. Как правило, для углеводородокисляющих бактерий может достигать 1 месяца и более. Пробирки с разведениями инкубируют при комнатной температуре, желательно не выше 20⁰С. В зимний период желательно проверять посевы на присутствие в них психрофильных форм бактерий. Поэтому в этом случае делают два посева из одной пробы воды, один из которых инкубируют при 5⁰С, а второй - при 20⁰С. Если посевы дают сравнимые результаты, в дальнейшем посевы из зимних пробы воды инкубируют при 20°С для более быстрого получения результатов.

О наличии роста в каждом из разведений пробы судят по общему помутнению содержимого пробирок, иногда сопровождаемому и изме­нением его цвета. В случае учета углеводородокисляющих бактерий их рост может иметь место только в поверхностной пленке углеводорода. Иногда он имеет вид пристенного кольца. Рост микроорганизмов обыч­но имеет место не во всех повторностях разведений, поэтому для расчета численности микроорганизмов в пробе обычно пользуются таблицами Мак-Креди (приложение 1), построенными на основе методов вариационной стати­стики.

Полученные результаты записать в тетради и сделать выводы.

2. Выделение чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов

Чистые культуры получают рассевом на минеральные агаризованные среды, на поверхность которых наносят стерильную нефть или ее фракции.

Для учета бактерий использовали среду Чапека с сульфатом аммония (г): KCl - 0,5; MgSO₄ x 7Н₂О - 0,5; K₂HPO₄ - 1; FeSO₄ - 0,01; (NH₄)₂SO₄ - 2,0; CaCO₃ - 3; агар - 20 г; вода морская - 1л. Стерильное дизельное топливо (летнее) наносили в количестве 2 капель на поверхность среды в чашке и затем тщательно растирали по всей поверхности шпателем. Эти операции осуществляли до посева проб воды.

При количественном учете углеводородокисляющих бактерий на жидкой среде, после появления видимого роста микроорганизмов осуществляли высев из первого и последнего положительных разведений на агаризованную среду Чапека с дизельным топливом.

Идентификацию углеводородокисляющих бактерий проводят по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. Полученные результаты записать в тетради и сделать вывод.