книги2 / 329

ЗАДАЧИ И ВОЗМОЖНОСТИ МЕЖДУНАРОДНОГО ТРАНСФЕРА ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Ответственныйредактор:

СукиасянАсатурАльбертович, к.э.н.

В состав редакционнойколлегии иорганизационногокомитетавходят:

3

АГЕНТСТВО МЕЖДУНАРОДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ● https://ami.im

4

ЗАДАЧИ И ВОЗМОЖНОСТИ МЕЖДУНАРОДНОГО ТРАНСФЕРА ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Шевкунова М.Е.

Бакалавр ФГАОУ ВО Омский Государственный Технический Университет г. Омск, Россия

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЛАДКОГО БЕЛКА МОНЕЛЛИНА ПУТЕМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Аннотация

В статье автор рассматривает качественный метод определения сладкого белка монеллина, являющегося лучшей альтернативой сахара на сегодняшний день. В статье освещен метод определения монеллина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В рамках исследования было выявлено, что молекулярная масса сладкого белка монеллина составляет 7 кДа.

Ключевые слова

Подсластители, монеллин, сладкие белки, биотехнологии, электрофорез.

Сахар вызывает ожирение, сахарный диабет, кариес и т.д. Ввиду того, что сахар вреден, началось активное производство и внедрение различных сахарозаменителей. В настоящий момент лучшей альтернативой сахара являются сладкие белки. Они не наносят вред организму и подходят для диабетиков, имея нулевой гликемический индекс [1, 2]. Однако единый метод качественного определения сладких белков еще не разработан. Как альтернатива, можно использовать электрофорез в полиакриламидном геле. Электрофорез белков является одним из способов разделения смеси белков на индивидуальные белки или фракции, в основе которого лежит движение заряженных белковых макромолекул различного молекулярного веса в стационарном электрическом поле.

Целью исследования является качественное определение сладкого белка монеллина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Задачи исследования – проведение качественного анализа сладкого белка монеллина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, определение молекулярной массы монеллина, выработанного с помощью штамма - продуцента сладкого белка монеллина Pichia pastoris Y39.

В исследовании использовались: сладкий белок монеллин, выработанный с помощью штамма - продуцента Pichia pastoris Y39; материалы: вертикальная камера для электрофореза белков, полиакриламидный гель, фиксирующий раствор, гельдокументирующая система BioRad.

Результаты исследования: при проведении электрофореза использовался полиакриламидный гель. Он состоит из разделяющего геля (14 %) и из концентрирующего геля (4 %). Концентрирующим гелем в электрофорезе является крупнопористый гель, который нужен для концентрирования белков пробы. А

5

АГЕНТСТВО МЕЖДУНАРОДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ● https://ami.im

разделяющим является нижний мелкопористый гель, в котором происходит разделение компонентов пробы. В результате молекулярно - ситового эффекта на границе между концентрирующим и разделяющим гелей ионы затормаживаются, то есть чем больше молекулярная масса анализируемого вещества, тем медленнее оно будет проходить через поры разделяющего геля.

Для приготовления разделяющего геля последовательно смешали буферный раствор Трис HCl, деонизированную воду, 40 % - й раствор акриламида (АА) и бисакриламида (bisAA), 10 % - й раствор додецилсульфата натрия (SDS), 10 % - й раствор персульфата аммония (PSA) и тетраметилэтилендиамин (TEMED).

Основой в растворе служит акриламид, а для сшивки полимеров акриламида используется бисакриламид. Для сополимеризации бисакриламида и акриламида используются TEMED и PSA. В качестве инициатора сополимеризации используется PSA, благодаря ему стимулируется радикал с неспаренным электроном, вызывая разрыв двойной связи и присоединение молекулы акриламида. По данному механизму встраивается бисакриламид. А для ускорения реакции полимеризации используется TEMED. Денатурация белков происходит путем обработки пробы трехкратным избытком SDS. Буферный раствор Трис HCl приготавливался с помощью растворения навески триса в объеме деонизированной воды с последующим доведением рН до необходимого значения добавлением соляной кислоты. Концентрирующий раствор готовится таким же способом, который был описан ранее.

Для проведения электрофореза залили приготовленный гель в специальные стеклянные пластины. Для этого собирали заливочный столик, согласно инструкции производителя, с помощью пипеточного дозатора на 5 мл залили разделяющий гель. Сверху налили 1 мл этилового спирта. Подождали пока гель полимеризуется (около 30 минут). Затем фильтровальной бумагой убирали спирт из камеры. После чего залили сверху разделяющий гель до заполнения. Далее вставили гребенку для электрофореза между стеклянных пластин и подождали пока гель полимеризуется (около 30 минут).

Собирали камеру для электрофореза. В кассету для электрофореза внесли раствор буфера Tris - Tricine. В камеру для электрофореза залили буфер Tris - HCl.

Подготовили белковый маркер: в пробирке Эппендорфа смешали маркер с буфером для нанесения и с деонизированной водой. Также подготовили анализируемые образцы: в пробирке Эппендорф смешали образцы с буфером для нанесения и с деонизированной водой, инкубировали в термостате при 95 оС.

Вынули гребенку из геля. В каждую лунку застывшего полиакриламидного геля внесли белковый маркер и подготовленные образцы. Подключили источник питания к электрофорезной камере и выставили на нем 15 мА. После того как образцы вошли в гель (примерно 15 минут) перевели режим на 25 мА.

Проводили электрофорез до тех пор, пока белковый фронт не достиг конца геля. После чего отключили источник питания, извлекли гели из стеклянных пластин. Извлеченные гели поместили в пластиковый контейнер и залили фиксирующим

6

ЗАДАЧИ И ВОЗМОЖНОСТИ МЕЖДУНАРОДНОГО ТРАНСФЕРА ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

раствором, оставили гели в растворе на 1 час. По истечении времени, фиксирующий раствор слили и залили гель красящим раствором на 5 - 10 минут.

После прокрашивания геля промыли его дистиллированной водой в отдельном контейнере и прокипятили в микроволновке до полного исчезновения фоновой окраски.

Результат анализировали с помощью гельдокументирующей системы BioRad (рис. 1). Данное оборудование способно делать снимок полученного геля с нанесенными образцами, по снимку оценили молекулярный вес сладкого белка монеллина, он составил 7 кДа.

Рисунок 1 – Электрофорез сладкого белка монеллина

Расшифровка рисунка 1: левая дорожка – белковый маркер от 0 до 150 кДа; правая дорожка – образец сладкого белка монеллина, выработанного штаммом - продуцентом монеллина P. pastoris Y39.

Список использованной литературы:

1.Yudkin J. Pure, White, and Deadly: How Sugar Is Killing Us and What We Can Do to Stop It / Penguin Books. – 2013. – P. 159–201.

2.Яковлева Е. Д. Влияние сахара на наш организм. Польза и вред сахара / Прочие технологии. – 2017. – С. 1–2.

©Шевкунова М.Е., 2023

7

АГЕНТСТВО МЕЖДУНАРОДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ● https://ami.im

8

ЗАДАЧИ И ВОЗМОЖНОСТИ МЕЖДУНАРОДНОГО ТРАНСФЕРА ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Павлидис С. Б.

Студент Российский государственный геологоразведочный университет имени Серго Орджоникидзе, Москва

ОСОБЕННОСТИ МЕТОДИКИ КАЛИЙ - АРГОНОВОГО МЕТОДА ДАТИРОВАНИЯ

Аннотация

В работе описаны особенности реализации калий - аргонового метода при изотопно - геохронологических исследованиях. Изучению подвергались пробы, отобранных в районе горы Партенит, Республика Крым. Автором подробно описана методика и аппаратная база эксперимента по датирования вулканитов. Исследования проводились в лаборатории изотопной геохимии и геохронологии ИГЕМ РАН.

Ключевые слова

калий - аргонового метода, изотопно - геохронологические исследования, пробы, погрешность измерения

Существует достаточно много геологических объектов, датировку образования которых с помощью стратиграфии выполнить можно лишь приблизительно. Решить эту проблему могут методы радиометрического определения абсолютного возраста. Одним из них является калий - аргоновый метод датирования. Этот метод базируется на определении радиогенного аргона - 40, который начинает накапливаться из К - 40 при образовании магматических пород. Таким образом, количество аргона (Ar - 40) по отношению к материнскому К - 40 является мерой времени, которое начинает отсчитываться с момента кристаллизации породы [1, 2].

Методика проведения калий - аргонового исследования реализовывалась на образцах вулканитов из района горы Партенит, Республика Крым. Базой исследования служила лаборатория изотопной геохимии и геохронологии ИГЕМ РАН.

Определение содержания радиогенного изотопа 40Ar проводилось методом изотопного разбавления с моноизотопом 38Ar в качестве трасера. Измерение изотопного состава аргона производилось на масс - спектрометре МИ - 1201ИГ, работающем в статическом режиме. Основные характеристики измерительного комплекса, созданного в ИГЕМ РАН на базе прибора МИ 1201 ИГ (чувствительность по аргону 5 10 - 3 А / торр и уровень холостого опыта - 510 - 10 нсм3) доведены до уровня лучшего зарубежного аналога - масс - спектрометра VG 5400 ("Мicromass", Англия). Точность измерений контролировалась систематическими измерениями содержания 40Arрад в стандартных образцах "биотит - 70А", мусковит

9

АГЕНТСТВО МЕЖДУНАРОДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ● https://ami.im

"Р - 207", биотит и мусковит "Bern - 4M", а также измерением изотопного состава воздушного аргона [1].

На приборе используются источник ионов с вольфрамовым катодом. Разделение ионного пучка по массам происходит с помощью электромагнитного анализатора с углом отклонения 90о. Приемник ионов имеет два коллектора и вторично - электорнный умножитель. Параметры источника позволяет производить измерения изотопных отношений аргона в условиях низкой масс - дискриминации, не превышающей 3 %.

Вприборе реализована безмасляная система откачки. Высокий вакуум (10 - 8Па)

ванализаторе масс - спектрометра обеспечивается работой триодного ионного насоса Varian StarCell и турбомолекулярного насоса Varian - V70LP.

Выделение аргона из образцов для масс - спектрометрического анализа происходит в экстракционной установке, входящей в масс - спектрометрический комплекс. Ее вакуумная откачка осуществляется криогенным форвакуумным и парортутным диффузионным насосами (остаточное давление 5·10 - 6Па). Шлюзовая камера обеспечивает возможность одновременной загрузки в экстракционную систему до 21 образца без нарушения высокого вакуума в других узлах масс - спектрометрического комплекса. Плавление навесок анализируемого вещества осуществляется в танталовом тигле. Для сброса образцов в тигель из шлюзового отсека используется магнитный толкатель. Очистка выделившегося аргона производится на двух ступенях поглотителей с титановыми и циркониевыми геттерами при температурах около 800оС. Очищенный аргон сорбируется на активированном угле, путем вымораживания жидким азотом, и напускаться в анализатор масс - спектрометра.

Управление измерительным процессом осуществляется с помощью компьютера, оснащенного периферийными устройствами. Измерительно - вычислительные программы, разработанные для использования масс - спектрометра, обеспечивают управление измерительным процессом, первичную (в реальном масштабе времени) и вторичную обработку данных измерений, геохронологические расчеты и управление базами данных.

Методика определения содержания радиогенного аргона (40Arрад) на масс - спектрометре МИ - 1201 ИГ включает следующую последовательность операций.

Подготовленные для анализа изотопного состава аргона образцы с известным весом заворачиваются в алюминиевые капсулы, которые помещаются в шлюзовую камеру экстракционной системы масс - спектрометра МИ - 1201 ИГ. После достижения в системе высокого вакуума производится предварительный прогрев образцов в течение 10 - 15 часов при температурах менее 200оС для удаления с их поверхности сорбированных газов.

Большинство минералов - геохронометров, используемых для K - Ar датирования, имеют температуру плавления от 1200 до 1500оС, поэтому в экстракционных системах производится нагрев образцов до 1600оС и образующийся расплав выдерживается при этой температуре в течение 5 минут

10