Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

книги из ГПНТБ / Краббе П. Применение хироптических методов в химии

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

23.10.2023

Размер:

5.75 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 / 1716 17 > Следующая >>>

150 Приложение

0,(%-ный водный раствор d-10-камфорсульфокислоты в

диапазоне 0,01° при длине волны 291 нм в кювете длиной
1 см. На диаграмме	должно наблюдаться	отклонение
94,7 мм.
Янг [2] предложил	в качестве стандартных	образцов

при измерении Д О В и К Д d-10-камфорсульфокислоту и

d-камфору.	В табл. 2 и 3 приводится молекулярное					вра
щение [М]х	и молекулярная эллиптичность			[0]* для		этих
контрольных соединений.					Таблица		2
					Таблица		2
Калибровка днхрографа по производным rf-камфоры [2]
О б р а з е ц	Растворитель	^мако	д е м а к с		Отклоне
О б р а з е ц	Растворитель	^мако	д е м а к с	град	ние, %
		11 м		град
d-10-Камфор-	Вода	290,5	.+2,20	+7260		1,61
с у л 1 фокисло-
та	Метанол	295,5	+ 1,54	+5080		1,56
d-Камфора	Метанол	295,5	+ 1,54	+5080		1,56
d-Камфора	Диоксан	299,5	+ 1,69	+5570		1,66
					Таблица		3
Оптическое вращение производных d-камфоры [2]
			Пик	Впадина
О б р а з е ц	Растворитель	к, нм	[М],			1Mb
			[М],	Л, нм		1Mb
			град	Л, нм		град
d-10-Камфор-	Вода	306	+4120	270	-5300
• сульфокисло-
та	Метанол	313	+3150	275	-3370
d-Камфора	Метанол	313	+3150	275	-3370
d-Камфора	Диоксан	316	+3980	277	-3500
d-10-Камфорсульфокислота			требует осторожного			обра

щения, так как она склонна поглощать влагу. Учитывая это, Янг [2] и Д е Тар [3] уточнили значение АеМ акс по на блюдаемой кривой Д О В с помощью уравнения Крони-

г а — К р а м е р с а .	Янг [2] вывел уравнение, связывающее
Д О В и КД :
f =	(2,20/АБ2 9 о,5)-([М]зоб/4120),

Измерение	ДОВ и КД	151
откуда получил значение f=	1,055. Таким образом,	если

количество воды, содержащейся в сИО-камфорсульфо-

кислоте,

неизвестно,

то Дегэо.б

можно

определить по

этому

уравнению,

исполь

зуя величину [М]зоб, полу

ченную

на

основании

из

№

мерения

Д О В . С

другой

-AMU

ТТЛ"TPГУ \

J\V.

стороны, Д е

Тар [3] при

водит

следующее

уравне

ние:

Д е м а к с

2,38- 1 0 '

4 Х

TRNV

Х ( [ М ] з о 5 - [ М ] 2 7 0 ) .

iот

Это уравнение дает воз

можность

уточнить

вели

чину

ЛБЩШС

помощью

измерения

амплитуды

250

ЗООнм

кривой

Д О В .

Величины

К Д

для

этого

случая,

уточненные

Янгом

Д е

Таром,

совпадают

при

ошибке

менее

чем

1,9%.

Рис.

5. Ложный пик при изме

рении КД.

K j C r A (12мг/100мл)

в 0,05

К.ОН,

1=1 см (оптическая плотность при

275 нм около 2,5); масштаб: 0,002 AD

на 10 см диаграммы; А — нормальные

ЗООНМ

сигнал, Б — ложный.

25Q

4. Контроль нулевой линии. Предельная оптическая

плотность, при которой прибор может работать в обыч ных условиях, равна 2,5. Оптически активные соедине ния, содержащие ароматический хромофор, измеряются при плотности 2,0—2,5, так как ароматические хромо форы (интенсивная полоса поглощения) дают обычно очень слабый эффект Коттона. В области, где поглоще ние света сравнительно велико, иногда* можно наблюдать ложный К Д далее для оптически неактивных соединений, обусловленный недостатками прибора. Чтобы проверить


152				Приложение
т а к ие	ложные		пики,	необходимо			измерить		Д О В	и	К Д
раствора		12 мг	К 2 С г 2 0 7 в		100	мл	0,05	н К О Н	при	275	нм
(рис.	5). Необходимо следить, чтобы при таких измере
ниях	ширина щели не была слишком большой.
5.	Обработка		кривых		ДОВ	и КД- В случае дисперсии
оптического вращения обозначим весь диапазон										ш к а л ы
через	5	(число	градусов		на	10	см д и а г р а м м ы ) ,			длину
волны — X, температуру — t(°C),						концентрацию— С (г/мл),
длину кюветы — / (дм),					молекулярный вес				образца —
М и	показание		прибора		на д и а г р а м м е — Н				(см) .	Тогда
получим		следующие		выражения:
	оптическое		вращение				а [ =	S • (#/10),
удельное вращение						[а][ =		a[j(C	• I),
	молекулярное вращение					[М]£ =		[а]£ • (М/100).

Удельное вращение является физической константой каждого вещества и служит для контроля чистоты и для идентификации веществ. Молекулярное вращение ис пользуется в конформационном и конфигурационном анализе.

В случае кругового дихроизма обозначим весь мас штаб ш к а л ы через 5 (&D на 10 см д и а г р а м м ы ) , концент

р а ц и ю — С (моль/л), длину кюветы — I (см) и показание прибора — Н (см) . Тогда получим выражение для цир кулярной дихроичной оптической плотности

для молекулярного циркулярного дихроичного коэф фициента поглощения

		л <	д	^
и д л я молекулярной		эллиптичности
		[е]( =	з з о о . д в ( .
Чтобы	получить	истинные		значения молекулярного
вращения	[М]£ и	молекулярной эллиптичности [9]£,

величины, определенные по указанным формулам, умно ж а ю т на множитель Лорентца 3 / ( « 2 + 2), где п — пока-

Измерение ДОВ и КД

153

Таблица 4

Показатели преломления и коротковолновый предел пропускания различных растворителей (I = 10 см)

	Коротковолновый
Растворитель *	предел пропускания	Показатель преломления
Растворитель *	(приблизительно),	Показатель преломления
	нм

Циклогексан	200			1,42900
Изооктан	200			1,3915
Четыреххлористый	250	n D	-	1,46305
углерод				1,44432
1,2-Дихлорэтан	220	nD		1,44432
Диоксан	220	n D	— 1,42241
Хлороформ	240	nD	=	1,44858
Метанол	210	„ 2	5	1,3276
Метанол	210	n D	=	1,3276
Этанол	220	„ 2	0	1,36139
Этанол	220	n D	=	1,36139
Вода	190	n D	-	1,333

• E P A (смесь этилового эфира,	изопентана	п этанола в	соотношении
5 : 5 : 2 ) используется при измерениях	при низкой	температуре,	а декалин —
при высокой температуре .

з а т е ль преломления раствора . Если растворы разбавлен ные, то можно использовать показатель преломления растворителя (табл. 4) . Этой поправкой пренебрегают в тех случаях, когда сравниваются образцы, растворен ные в одинаковых растворителях.

				4. ТЕХНИКА ИЗМЕРЕНИЙ
Техника		измерений Д О В и К Д в основном одинакова.
Необходимо		отметить, однако,			что на К Д мало			влияют
н а п р я ж е н и я		в окнах кюветы и их загрязнение,					мутность
исследуемого			раствора и другие и с к а ж а ю щ и е				факторы .
Д О В , которая			непосредственно		зависит	от поляризации,
наоборот,	легко			подвержена	действию	э т и *	факторов.
В зависимости от условий, в					которых	находится		обра
зец, это	может			быть раствор,	кристалл, таблетка или

154 Приложение

газ. Наиболее часто используются растворы. Если иссле^

дуемый образец находится в виде кристалла,			таблетки
или	газа, то развертка по спектру осуществляется так
же,	как и в	случае раствора.
Условия,		желательные для анализа данного	образца,

не всегда совместимы с оптимальными условиями изме рений на данном приборе. В качестве примера можно указать на изучение конформации и конфигурации бел ковых ферментов методами Д О В и К Д . Если для изуче ния используют тартратный буфер, то этот буфер погло щает свет и делает невозможным наблюдение эффектов Коттона, обусловленных структурой белка, при длинах волн менее 250 нм. Концентрация образца, используемая для изучения активности фермента, часто отличается от оптимальной концентрации, которую можно измерить на приборе. Имеется ряд образцов, которые можно изме рить при тщательно выбранных условиях, таких, как

концентрация, длина				кюветы, диапазон ш к а л ы				Д О В и
К Д .	Во	многих случаях,				однако,	приходится	больше
считаться с условиями измерения на							приборе, чем с усло
виями,		желательными			для	анализа	данного	образца .
Н и ж е	будут		рассмотрены измерения				Д О В и К Д , опти
мальные		для	прибора.
	4.1. Калибровка				измерительных		приборов
Д л я		взвешивания		нескольких миллиграммов				о б р а з ц а
с ошибкой не			более	1%	требуются микровесы.			Измери

тельные колбы и пипетки д о л ж н ы быть предварительно прокалиброваны . Так как длина кювет обычно имеет абсолютную ошибку в пределах ± 0 , 0 5 мм, то необхо димо прокалибровать кюветы длиной от 0,1 до 5 мм с по

мощью калибровочных	кривых	Д О В	и	КД,	снятых	с ис
пользованием кюветы	длиной	10	мм.	Д л я измерений
в кюветах длиной 0,1—1 мм		желательно			использовать
высокочувствительный	интервал измерений				Д О В и	К Д

или исследовать раствор образца с более высокой кон центрацией.

Л 4.2. Выбор растворителя

Д л я измерения Д О В и К Д используются те лее рас творители, что и для измерений . УФ-спектров поглоще-

Измерение ДОВ	и КД	155
ния. Предпочтительны т а к ж е	растворители,	которые

имеют малое поглощение при коротких длинах волн и являются хорошими растворителями для соединений раз личных классов. Вода (включая различные буферные растворы) широко используется в биохимических иссле дованиях, метанол и диоксан наиболее часто применяются при изучении органических соединений. В органиче ской химии конформация соединений и степень воздей ствия растворителя часто зависят от полярности приме ненного растворителя; при анализе белков особенно сильное влияние оказывает рН раствора. Так как обыч ные органические растворители содержат примеси аро матических соединений, желательно очищать их хроматографически с помощью силикагеля. Кроме того, для измерений Д О В и К Д удобно использовать растворители марки «спектроскопически чистые». Растворители, кото рые легко поглощают влагу, д о л ж н ы быть осушены с помощью активированной окиси алюминия или сили кагеля. Необходимо т а к ж е иметь в виду, что органиче ские растворители перед их использованием для измере ния должны принять комнатную температуру. Если тем пература, при которой приготовлен раствор образца, и

температура		измерения различаются, то это приводит
к	изменению	объема растворителя и вносит ошибку
в измеряемые		величины.
	4.3.	Подбор		концентрации		раствора
			и	длины	кюветы
	Спектрополяриметр ORD/UV-5 имеет набор из 12 кю
вет	длиной от	100	до	0,1 мм. Д л я измерений при			длинах
волн больше		250	нм,	где	растворитель имеет		большое

пропускание, в качестве стандарта используют концен трации образца около 0,1% для кюветы длиной 10. мм. При длинах волн, где растворитель у ж е значительно по

глощает свет, применяют обычно тонкие кюветы					длиной
1	мм	или	около	0,1 мм. При уменьшении длины	кюветы
в	10	раз	предел	пропускания растворителя сдвигается

в коротковолновую область приблизительно на 10 нм. Поскольку эффекты Коттона при измерении Д О В и КД проявляются в области полосы поглощения образца, из мерения производятся в условиях, когда интенсивность

									Таблица 5
		Условия приготовления образца и масштаб шкалы
	Хромофор		Область	длин	Концентра	Длина кюветы	Масштаб	шка М а с ш т а б шка
	Хромофор		волн,	нм	ция, »/„	Длина кюветы	лы К Д ,	AD	лы Д О В , град
Кетон, альдегид			ян>-я*240—350		0,1	1 см	0,002—0,02		0,1—2
а, В-Ненасыщенный кетон			п. -> хс*280—400		0,1	1 см	0,002-0,02		0,1-2
			п -> я*200—280		0,1	1 мм или короче	0,002-0,005		0,1—0,2
—СООН,	лактон, эфир		ге->я*210-230		0,1	10—1 мм	0,002—0,02		0,1-2
Сопряженная двойная связь			тс -> я*200—300		од	1 мм или короче	0,002-0,005		0,1—0,2
Аромати	боковая	цепь	250—300		0,01-0,02	1 см	0,002		0,1—0,2
ческий			200-250		0,01-0,02	1 мм или короче	0,002		0,1
хромофор главная		цепь	250—300		од	1 см	0,002		0,1-0,2
			200—250		0,1	1 мм или короче	0,002		0,1
S—S (Этилентиокеталь)			п н- а*200-300 \|		0,1	1 см	0,002—0,02		0,1-0,5
Белок			Ароматическая
			цепь
			250-320		0,1	1 см	0,002		0,1-1
			л -> 31*200—250		0,1	1 мм или короче	0,002—0,005		0,1-0,2
ДНК, РНК			200—300		0,1	1 мм	0,002		0,1
Хелатное	соединение	ко	d -> d*300—700		0,2	1 см	0,005—0,02		0,1-2
бальта			СГ-полоса
			200-300		0,1	0,1 мм	0,002		0,1

Измерение ДОВ и КД

Г57

светового потока низка. Поэтому при выборе концентра ции образца и длины кюветы в к а ж д о м отдельном случае

необходимо принимать во внимание поглощение образца,
интенсивность эффекта	Коттона и область длин волн, при
которых производится	измерение. Д л я	того чтобы	избе
ж а т ь помех, и с к а ж а ю щ и х результаты,		например,	рас

сеяния света, измерения необходимо проводить при оптической плотности образца не выше 2,5. Данные, ко торыми обычно руководствуются при приготовлении об

разцов	и выборе масштаба шкалы, приведены	в	т а б л . 5 .
Д л я	измерения плавной части кривой Д О	В	обычно

используют кювету длиной 100 мм и концентрацию об разца 0,1—1%. Количество образца д л я каждого типа

кювет приведено в табл .		6.
						Таблица 6
Размер	кювет	и количество			образца,
требуемое		для	их заполнения
	Длинл и на		Ошибка		в	Количество
Форма кюветы	Длинл и на		определении			образца	для
Форма кюветы	кюветы,		длины,			заполнения
	мм		мм			кюветы,	мл
	100		±0,05			5 или немно
						го больше
	50		То	же		2,5
Цилиндричес	20		»	>		1
кая	10					0,5
	20					4
	10					2
Прямоугольная	5					1
	2					0,4
	1					0,2
U-образная	0,5		»	»		0,1
U-образная	0,2		±0,02			0,04
	0,1		То	же		0,01
4.4. Подготовка		прибора		к	измерениям

Измерения Д О В и К Д на спектрополяриметре модели ORD/UV-5 производятся при одинаковых условиях. Время прогревания прибора равно приблизительно

158		Приложение
15—30 мин. Так	ж е	как	и в	некоторых других приборах
для измерения	Д О В	и	К Д ,	нулевая линия может сме

щаться, поэтому во время прогревания необходимо про верять ее положение при определенной длине волны. Проверка прибора перед измерением проводится в сле дующем порядке.

1. Проверка нулевой линии при измерении Д О В и К Д

Нулевую линию необходимо проверять перед измере нием и после него на максимальной чувствительности прибора (масштаб шкалы ± 0 , 1 ° для Д О В и ± 0 , 0 0 2 AD для КД) при определенной длине волны.

2. Положение кюветы

Правильное положение кюветы является очень важ ным фактором для проведения точного измерения. Окош-

1г	- Оптическая
	оса

	2		4
Рис. 6.	Кюветы и держатель кювет.
/ — ц и л и н д р и ч е с к а я термостатируемая		кювета;	2—прямоугольная	кювета;
3—прокладка;	4—U-образная	кювета	(вид спереди),

ки кюветы д о л ж н ы быть чистыми, для чего их необхо димо тщательно протирать марлей, смоченной в спирте. Перед измерением кювета ставится в положение, пока-

	Измерение	ДОВ и КД	159
занное	на рис. 6. Д е р ж а т е л ь	кюветы необходимо	фикси
ровать	по отношению к оптической оси. Кювету		следует

устанавливать в одном и том ж е положении. Когда ис пользуется прямоугольная кювета, ее сторона с выграви рованной надписью д о л ж н а быть обращена к падающему лучу. Кювета в держателе должна находиться в фикси рованном положении. Необходимо помнить, чт.о положе ние кюветы является наиболее в а ж н ы м фактором при определении очень слабых эффектов Коттона, особенно

для

образцов,

измерение

Д О В и

К Д которых

требует

большой тщательности. Вообще, измерения

Д О В тре

буют большей тщательности, чем измерения КД .

Выбор масштаба

шкалы и скорости развертки

спектра

Развертка длин

волн при измерении как Д О В , так и

К Д

в области

поглощения

образцов (где

интенсивность

светового

луча

низка)

проводится

при скоростях

более

низких,

чем при измерении

поглощения. Различие

в тех

нике

измерений Д О В и К Д состоит в том, что скорость

развертки

при

измерении

К Д обычно в два

или

более

раза меньше, так как значение временной

константы уси

лителя

при измерении

К Д

больше, чем при

измерении

Д О В .

После установки кюветы в фиксированном

положе

нии относительно оптической оси следует

подобрать

условия

измерения.

а.

Выбор

величины

поглощения

образца

масштаба

шкалы.

Когда

величина

поглощения образца

превышает

2,5—3, напряжение на фотоумножителе возрастает до верхнего предела. В этих условиях после установки под ходящего масштаба шкалы .необходимо подобрать об ласть длин волн, где наблюдается эффект Коттона. За тем нужно отметить напряжение на фотоумножителе,

когда оно достигнет		верхнего предела (800—1000		В при
измерении Д О В	и	600 В	при измерении К Д ) .	Когда
верхний предел	достигнут,		отмечается интервал	длин

волн (несколько десятков нанометров), после которого напряжение снова понижается. Необходимо т а к ж е най ти приблизительную величину Д О В или КД, чтобы опре делить концентрацию образца и' длину кюветы. Затем

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 / 1716 17 > Следующая >>>

Соседние файлы в папке книги из ГПНТБ