диссертации / 73

После этого образцы зажимали в миниатюрных зажимах, которые устанавливали на расстояние 15 мм друг от друга. С предварительным натяжением 10 сН пробы растягивали до разрыва со скоростью 0.2 мм/сек. На диаграммах “Strength – Strain”

определяли разрывные и эластические показатели c последующим расчетом услов-

ного модуля эластичности.

А Б

Рис. 12. A – диаграммы растяжения в двух направлениях до разрыва, Б – диаграмма многоцикловой нагрузки 4 Н/см.

2.3.5 Многоцикловые испытания протезов на растяжение.

Для многоцикловых тестов на растяжения использовали универсальную од-

ноколонную установку «TA.XTplus Texture Analyser» в той же комплектации, что и в тестах на растяжения до разрыва. Перед многоцикловыми испытаниями из про-

тезов Parietene light, Dyna light и Ultrapro вырезали пробы вдоль и поперек петель-

ных столбиков размером 50 х 20 мм, которые зажимали в стандартных зажимах и устанавливали рабочую длину 30 мм. Образцам сообщалось преднатяжение 0.1 Н,

после чего они проходили через 100 циклов растяжения с максимальной нагрузкой

4 Н/см. На полученных диаграммах многоцикловых тестов определяли полную и остаточную деформацию проб (рис. 12Б). После 20 мин отдыха структуру проб снимали под стереомикроскопом. На стереомикроснимках оценивали смещение элементарных звеньев и определяли изменение поверхностной пористости.

81

2.3.6Испытание протезов на изгиб.

Испытания на изгиб проводили по методу петлевого теста на универсальной

установке «TA.XTplus Texture Analyser». В резьбовое гнездо подвижной траверсы вместо стандартного зажима вворачивали стержень-адаптер, к которому был при-

креплен металлический диск диаметром 50 мм с полированной нижней поверхно-

стью. Из СЭ в продольном и поперечном направлениях выкраивали по 4 пробы раз-

мером 110 х 40 мм. Полоски сгибали и устанавливали в нижний зажим в виде петли высотой 40 мм. Металлический диск сжимал петлю на 15 мм со скоростью 2

мм/сек, после чего с той же скоростью возвращался в исходное положение (рис. 13А). Сначала пробу устанавливали и сжимали лицевой стороной наружу, через час отдыха тест повторяли изнаночной стороной наружу. На диаграммах «сжатия

– распрямления» определяли жесткость и упругость при изгибе (рис. 13Б). Жестко-

стью являлось усилие необходимое для прогиба петли на 15 мм. Упругость рассчи-

тывали, как отношение работы распрямления к работе сжатия. Работа распрямле-

ния соответствовала площади по нижней кривой, а работа сжатия – площади под верхней кривой.

А Б

Рис. 13. Испытание на изгиб. А – петлевой тест, Б – расчет жесткости и упругости на изгиб.

2.3.7 Гистологические исследования.

Техника приготовления и окрашивания гистологических срезов.

После стереомикроскопии переднюю брюшную стенку животного помещали на пробковую плату и крепили по краям иглами из нержавеющей стали, а затем плату переворачивали нижней частью вверх и опускали в ванночку, заполненную

82

10% забуференным формалином. Благодаря этому способу фиксации эксплантированные ПБС сохраняли анатомо-топографические ориентиры и особенности строения. Размеры протезов до и после фиксации в формалине практически не отличались от исходных. Через 2 суток фиксированные ПБС перекладывали в пластиковый стаканчик с 10% формалином и хранили в холодильнике при t +6°С. Для приготовления препаратов ПБС укладывали на предметный столик стерео микроскопа и под увеличением 7.5 или 10 скальпелем №10 вырезали из протезированной области полоски ткани 20 – 25 мм в длину и 10 мм в ширину (рис. 21). Пробы вырезали в продольном и поперечном направлениях, так чтобы длинная сторона препарата проходила вдоль петельного столбика или ряда. С противоположной стороны оставляли мышечную ткань, после чего препараты помещали в tissue tek и маркировали. Промывка, обезвоживание и пропитка парафином проводилась в автоматическом режиме на аппарате карусельного типа АГТ-11. Затем препараты заключались в парафиновые блоки. Гистологические срезы производили на микротоме ротационного типа толщиной 5 мкм. В ситуациях, когда срезы включали большое количество полимерных волокон и расщеплялись, их толщину увеличивали до 7 – 8

мкм. Приклеенные к предметным стеклам срезы освобождали от парафина и затем окрашивали в программируемой автоматической станции. От каждого парафинового блока получали 4 среза, два окрашивали гематоксилином и эозином и два по ван Гизону. В ряде экспериментов готовили дополнительные срезы, которые окрашивали по Маллори или Сириус ред.

Микроскопия и визуализация срезов.

Для изучения окрашенных гистологических срезов использовали прямой исследовательский микроскоп Motic BA-400 Trinocular с оптической схемой, рассчитанной на бесконечность. Модульная конструкция микроскопа была оборудована широкопольными окулярами (WF PL 10x/22), усовершенствованной системой освещения по Келлеру, ахроматичесеским конденсором с откидной линзой и 5 объективами план ахромат (4х/0.10, 10х/0.25, 40х/0.65, 60х/0.85 и 100х/1.25 масло). К видеовыходу оптической насадки микроскопа с разделителем светового потока

83

(80/20), используя видеоадаптер C0.5x 1/2", присоединяли микроскопную цифро-

вую камеру Moticam 3000C и подключали к ноутбуку. В компьютерной программе

Motic Images Advanced 3.2 открывали окно для визуализации и в режиме live view

изучали гистологические срезы и регистрировали изображения. В аналитической части программы осуществляли измерения микрообъектов и проводили пиксель-

ный анализ цветных изображений. Кроме того, используя приложение к программе

Motic Images Advanced 3.2, производили сшивку микроснимков, полученных при х100 увеличении, с последующим воссозданием панорамных изображений высо-

кой четкости.

Оценка воспалительной реакции.

Гистологические исследования реакций на инородное тело, вызванных раз-

личными текстильными структурами протезов, проводили в срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. В препаратах оценивали выраженность продолжающе-

гося воспалительного процесса и тяжесть уже сформировавшихся осложнений.

При определении степени выраженности воспалительного процесса учитывали клеточный состав инфильтрата, распространенность клеточной инфильтрации, со-

держание грануляционной ткани и её вид, а также плотность микрососудов вокруг переплетений. Среди последствий длительного нахождения протеза выделяли кро-

воизлияния различной степени давности, наличие гранулем, фиброз, гиалинизацию и формирование невром. Степень интенсивности воспалительной реакции оцени-

вали от 0 до 4 баллов. За нулевую степень принимали воспалительную реакцию в срезах ПБС контрольных животных, у которых создавали грыжевую модель без пластики дефекта.

Морфометрический анализ соединительной ткани.

Гистологические срезы, окрашенные по Ван-Гизону и Маллори-Вайсу, сни-

мали на микроскопную камеру. После этого на снимках в полуавтоматическом ре-

жиме однородно окрашивали поперечные срезы волокон и воспалительные ин-

фильтраты. Приступая к морфометрии, выделяли 3 зоны интереса. Первая зона находилась в области узловых соединений нитей (рис.14А), вторая представляла собой свободные промежутки или поры (рис.14Б), а третья охватывала протез и

84

слой соединительной ткани на большом протяжении, т.е. включала как узлы, так и поры (рис.14В). Мультипиксельный анализ в выделенных зонах рассчитывал пло-

щадь объектов каждого цвета и, таким образом, позволял определить парциальное содержание различных структур в гистологических срезах и количественно оцени-

вать образование зрелой соединительной ткани вокруг протеза.

Рис. 14. Морфометрический анализ в 3-х зонах интереса: А – узловых соединений, Б – свободных промежутков, В – вокруг структуры протеза.

Определение соотношения I/III типов коллагена.

Соотношение коллагена I/III типу определяли при кросс-поляризационной микроскопии. Для кросс-поляризационной микроскопии срезы, толщиной 5 мкм,

окрашивали в течение 1 часа в растворе пикросириуса (0.1% раствор сириуса крас-

ного в насыщенном растворе водной пикриновой кислоты, рН 2) в соответствии с методикой Junqueira et al. (1978 г). Срезы затем промывали в течение 2 мин в 0.01

Н HCl, дегидратировали, очищали и заключали в синтетическую смолу.

При кросс-поляризации срезов более толстые волокна коллагена I типа окра-

шивались в красно-оранжевые оттенки, а более тонкие волокна коллагена III типа

– в бледно зеленые. Для каждой пробы 10 областей в пространстве между сеткой и тканью хозяина (х400, площадь 100 х 100 мкм) фотографировали, используя циф-

ровую камеру (Olympus C-3030, Olympus, Hamburg, Germany). Соотношение кол-

лагена I/III типов получали путем анализа площадей, занимаемых коллагеном I и III типов, используя программное обеспечение для анализа изображений (ImagePro Plus, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).

85

Определение ММР-2.

Для определения матриксной металлопротеиназы – 2 (ММР-2), использовали поликлональные антитела кролика, 1:1.000 от Biomol (Hamburg, Germany) в каче-

стве первичного антитела и козьи антикроличьи, 1:500 от Dako (Glostrup, Denmark)

в качестве вторичного антитела. Все срезы анализировали методом стандартной световой микроскопии (Olympus BX51, Olympus, Hamburg, Germany). Процент по-

зитивно окрашенных клеток оценивали в пространстве между сеткой и тканью хо-

зяина (х400, площадь 100 х 100 мкм, непосредственно рядом с волокном сетки).

Анализ выполняли с использованием программного обеспечения для анализа изоб-

ражений (Image-Pro Plus, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) после выпол-

нения снимков исследуемых областей (Olympus C-3030, Olympus, Hamburg, Germany). Для каждого животного, каждой сетки и имплантационного периода было выполнено три исследования. Определение иммуногистохимических параметров проводили полуколичественным методом по шкале иммуннореактивности в соот-

ветствии с методом Remmele and Stegner (1987 г). Интенсивность окрашивания оце-

нивали в баллах: 1 (негативное), 2 (слабое), 3 (среднее) и 4 (интенсивное). Степень окрашивания оценивали в баллах: 1 (0%), 2 (10%), 3 (11-50%), 4 (51-80%) и 5 (81-

100%), которые указывали на процент позитивного окрашивания в пространстве сетка – ткань хозяина. Умножение степени интенсивности (1-4) на степень окраши-

вания (1-5) давало в результате баллы, характеризующие иммуннореактивность (1- 20).

2.3.8 Определение оксидативных повреждений нитей.

Используя стереомикроскоп, в проходящем свете из фиксированных в фор-

малине протезированных ПБС вырезали пробы размером 1 х 1 см, содержащие ма-

териал сетки. Вырезанные пробы помещали в в раствор гипохлорита натрия, содер-

жащего 6 – 14% активного хлора (Sigma) и инкубировали в течение 2 – 3 часов при температуре 370С. Затем производили удаление остатков ткани путем струйного

86

промывания теплой водой. В заключение образцы промывали несколько раз ди-

стиллированной водой для удаления следов гипохлорита натрия и оставляли на ночь для высушивания.

Образцы эксплантированной, интактной или подвергнутой определенным воз-

действиям сетки (каждого типа) методом сканирующей электронной микроскопии исследовали на наличие поперечных трещин, указывающих на окислительное по-

вреждение полимера. Микрофотографии были получены с помощью сканирую-

щего электронного микроскопа Hitachi S-4700 с вторичным электронным детекто-

ром при ускоряющем напряжении 5 кэВ. Перед исследованием на каждый иссле-

дуемый образец было произведено напыление платины при 20 мА в течение 2 мин

(Emitech K575X Peltier Cooled Sputter Coater; Emitech Products Inc, Houston, Texas).

Контрольное исследование показало, что воздействие растворов формалина и ги-

похлорита натрия (используемых для фиксации и удаления ткани) на образцы ин-

тактных сеток не вызвало появление оксидативных повреждений волокон.

2.3.9Методы статистической обработки результатов исследования.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с исполь-

зованием программного пакета для статистического анализа STATISTICA 10 (StatSoft, Inc., USA). Различия считались статистически значимыми при р-уровне

<0.05.

Описательная статистика непрерывных количественных данных представ-

лена в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (+SD) при нормаль-

ном распределении. Для определения нормальности распределения использовали одновыборочный критерий нормальности Колмогорова-Смирнова. Нормальным принималось распределение, у которого значение D статистики было выше 0.05.

Аналитическая статистика выполнялась с использованием парного t-теста Стьюдента для независимых выборок; однофакторного и многофакторного диспер-

сионного анализа (ANOVA/MANOVA) с последующим выполнением апостериор-

ного сравнения и определением критерия Тьюки достоверно значимой разницы.

Достоверно значимой принималась разница при р-уровне <0.05.

87

Глава 3. Результаты исследований.

3.1 Воздействие биоактивных субстанций на процесс формирование рубцовой

ткани при имплантации протеза. (1-я серия).

Макроскопические наблюдения.

При клиническом наблюдении в течение 90 дней после имплантации не было выявлено гематом, сером или признаков инфекции. У одной крысы (аскорбиновая кислота) была выявлена протрузия края сетки через кожу. У большинства живот-

ных (вне зависимости от вида фармакологического агента) присутствовали при-

знаки асептического воспаления (покраснение и отечность кожи) в раннем после-

операционном периоде, которые позже исчезали самостоятельно.

Соотношение коллаген/белок

В исследовании количества коллагена было обнаружено, что добавление док-

сициклина (39.3+7.0 г/мг) и гиалуроновой кислоты (34.4+5.8 г/мг) привело к досто-

верному, по сравнению с контрольной группой (28.3+1.9 г/мг), повышению соот-

ношения коллаген/белок через 90 дней после имплантации (Рис.15А).

Кросс-поляризационная микроскопия

В целом, увеличение соотношения коллагена I/III типа, свидетельствующее о созревании рубца, было выявлено во всех группах. Однако не было обнаружено достоверных различий между образцами сеток с фармакологическими агентами и контрольной группой через 7 и 90 дней после имплантации (Рис.15Б).

А Б

Рис.15. Диаграммы: А – содержание коллагена, Б – соотношение I/III типов коллагена – в группах через 7 и 90 дней после имплантации.

88

Таким образом, в нашем исследовании, посвященном изучению влияния сет-

чатого материала с биологически активными агентами, не было отмечено улучше-

ния качества образующейся вокруг сетки рубцовой ткани. Дальнейшие исследова-

ния должны быть направлены на поиск способа контролируемого высвобождения лекарственного вещества для оптимизации его поступления в ткани. Также необ-

ходимы исследования дополнительных агентов, способных снизить интенсивность реакции на имплантируемые инородные материалы. Но, главное, это изучение фак-

торов взаимодействия протеза с окружающими тканями, связанных с его располо-

жением, структурой и биомеханическими свойствами. С нашей точки зрения,

только после оптимизации конструкций протезов можно эффективно реализовать первые два положения.

3.2 Влияние расположения протеза относительно мышечного слоя на воспа-

лительный ответ и образование коллагена. (2-я серия).

Макроскопические наблюдения.

Хирургическая процедура была хорошо перенесена всеми животными. По-

слеоперационный период протекал без осложнений. Ни у одного животного не было отмечено признаков местного или системного воспаления.

Гистологический анализ гранулемы инородного тела

Микроскопическое исследование пространства сетка/ткань хозяина показало типичное формирование гранулем инородного тела. Эти гранулемы включали эпи-

телиальные клетки и гигантские клетки. Небольшое количество полиморфноядер-

ных гранулоцитов регулярно обнаруживалось в исследуемом пространстве. Воспа-

лительный процесс сопровождался выраженным перифиламентарным фиброзом.

Диаметры внутренней части гранулемы инородного тела, отражающие количество воспалительных клеток в инфильтрате, через 60 дней после имплантации не пока-

зали достоверной разницы между группами sublay и onlay имплантации. (PP sublay 13.1 ± 1.2 мкм vs. PP onlay 13.1 ± 1.2 мкм; P = 1.000) (PP-PG sublay 11.7 ± 0.3 мкм

89

vs. PP-PG onlay 11.2 ± 0.6 мкм; P = 0.093). Отличия размеров внутренней части гра-

нулем у разных типов сеток были достоверны, но они коррелировали с разной тол-

щиной нити, которая у PP-PG сеток была на 3 мкм меньше, чем у PP сеток.

Соотношение коллагена I/III типа

Исследование соотношений коллагена I и III типа, показало, что через 60 дней после имплантации соотношения I/III были достоверно выше в группах sublay, чем onlay. (PP sublay 3.1 ± 0.2 vs. PP onlay 2.4 ± 0.4; P = 0.004) (PP-PG sublay 3.5 ± 0.3 vs. PP-PG onlay 2.6 ± 0.1; P = 0.002). При сравнении типов материалов в группах sublay статистически значимых различий выявлено не было (Р=0.132). Аналогично,

соотношение типов коллагена не отличалось достоверно (p=0.485) у разных типов сеток при надфасциальном расположении (Рис. 16А).

Матриксная металлопротеиназа -2

При исследовании экспрессии ММР-2 в пространстве между сеткой и тканью хозяина не было обнаружено статистически значимых различий ни между положе-

нием сетки (PP sublay 10.6 ± 3.3 vs. PP onlay 8.3 ± 3.1; P = 0.310) (PP-PG sublay 10.3

± 3.3 vs. PP-PG onlay 10.5 ± 2.4; P = 1.000), ни между типами сеток (PP sublay vs.

PP-PG sublay P = 0.937) (PP onlay vs. PP-PG onlay P = 0.310) (Рис. 16Б)

Рис. 16. Графическое изображение: А – соотношение коллагена I/III типов, Б – экспрессия ММР-2 – через 60 дней после sublay и onlay пластики

.

90