Ультраструктура бактериальной клетки.

Бактерии относятся к прокариотам, устроенным более примитивно, чем эукариоты (растительные и животные клетки).

Сходства в строении клеток эукариот и прокариот:

• Клеточное строение;

• Наличие цитоплазматической мембраны;

• Наличие цитоплазмы;

• Единая форма наследственности – ДНК.

Различия в строении клеток эукариот и прокариот:

Эукариоты	Прокариоты
Дифференцированное ядро (ядерная мембрана, ядрышки, гистонные белки)	Недифференцированное ядро (нуклеоид, неотделенный от цитоплазмы мембраной, не содержат гистоны)
Диплоидный набор хромосом	Гаплоидный набор хромосом
Линейная ДНК	Циркулярная ДНК
Размножение путем митоза	Бинарное деление
Мембранные органеллы (ЭПС, аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии)	Не имеют мембранных органелл
Рибосомы 2-х видов: 80S – в	Только 70S рибосомы

цитоплазме и 70S – в органеллах
Клеточная стенка не содержит пептидогликан	Клеточная стенка содержит пептидогликан
Внехромосомные факторы наследственности (ДНК) содержатся в митохондриях и хлоропластах	Внехромосомные факторы наследственности (плазмиды) содержатся в цитоплазме

15. Приготовление и окраска препаратов-мазков.

Приготовление состоит из нескольких последовательных операций: подготовка мазка, высушивание, фиксация и окраска. Исследуемый материал наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Для взятия бактериальной культуры: - нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки; - берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони; - обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут исследуемый материал; - вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой. - взятый материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени спиртовки;

- если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора - мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем горелки. Нельзя допускать закипания материала, т.к. при этом может нарушиться структура микроорганизмов. - фиксация препарата: высушенные мазки подвергают термической (предметное стекло (мазком вверх) проводят несколько раз через пламя горелки) или химической (фиксирующие растворы: формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнау, ацетон, пары осмиевой кислоты) обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла.

Методы окраски Простые методы (ориентировочные) Сложные методы (дифференцирующие)

1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним красителем анилино-вого ряда (основным или кислым): кислый фуксин, метиленовый синий, эозин, генциановый фиолетовый. 1. Применяют для изучения структуры клеток, дифференциации микроорганизмов. 2. Используют несколько красителей. Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Романовского-Гимза, Нейссера Гинса-Бурри и др.

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители. Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

Окраска по Граму. Сущность метода Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет. У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму (этапы окраски по Граму представлены на стенде). На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают. Наносят раствор Люголя на 1 мин. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. Препарат промывают водой. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Окраска по Цилю-Нильсену Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов, воска и оксикислот. Принцип основан на том, что кислотоустойчивые бактерии за счет содержания указанных веществ прочно связывают карболовый фуксин при нагревании (т.е. окрашиваются в красный цвет) и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и при использовании дополнительного красителя - метиленового синего – окрашиваются в синий свет. Методика окраски по Цилю-Нильсену: На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин. Снять бумагу, промыть мазок водой. Нанести 5 % раствор серной кислоты на 1-2 мин до обесцвечивания. Промыть водой. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Окраска по Ожешко Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым фуксином. Споры кислотоустойчивы, поэтому красятся в красный цвет. Методика окраски по Ожешко:

На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий. Окраска по Романовскому-Гимзе

Методика окраски по Романовскому-Гимзе: Краска Романовского-Гимзе состоит из метиленового синего, эозина и азура.

На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.