52. Реакции иммунитета: реакция связывания комплемента (рск), иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ (ингредиенты, механизм, способы постановки, результат, практическое применение).

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Принцип реакции связывания комплемента (РСК) основан на способности комплемента вызывать цитолиз по классическому пути. Индикатором искомого взаимодействия антигена и антител является гемолитическая система - смесь эритроцитов (например, барана) с антиэритроцитарной сывороткой. Если происходит искомое взаимодействие антигена с антителами, образуются иммунные комплексы, которые связывают комплемент, внесенный в реакционную смесь. В этом случае эритроциты гемолитической системы, добавленные на 2-м этапе, остаются интактными. В случае отсутствия специфичности антител к антигену иммунные комплексы не образуются, комплемент остается в реакционной смеси и затрачивается на лизис индикаторных эритроцитов.

Ингредиенты:  АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Механизм и способы постановки: В фазе I (специфической) реакции связывания комплемента ( РСК ) искомый Аг (или AT) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент.

В фазе II (индикаторной) реакции связывания комплемента ( РСК ) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы — эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей AT к ним. Если Аг и AT не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит. В этом . случае свободный комплемент взаимодействует с компонентами гемолитической системы, фиксируясь на комплексе эритроцит-антиэритроцита рное AT. Следствие этого — гемолиз индикаторных клеток (феномен «лаковой крови») — реакцию считают отрицательной.

Если в фазе I реакции связывания комплемента ( РСК ) AT и Аг соответствуют друг другу, то образующиеся иммунные комплексы связывают комплемент, разрушения эритроцитов после внесения гемолитической системы не наблюдают и реакцию считают положительной.

Реакция иммунофлюоресценции, или метод Кунса Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с ком­плементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антиге­нов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светить­ся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.тБактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по пери­ферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в вы­явлении комплекса антиген—антитело с по­мощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабаты­вают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, от­мывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобули­новой (антикроличьей) сывороткой, мечен­ной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).

Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.

Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.

Компоненты прямой РИФ: 1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.); 2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену; 3) изотонический раствор хлорида натрия. Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой. Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.

Компоненты непрямой РИФ: 1) исследуемый материал; 2) специфическая антисыворотка; 3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом; 4) Изотонический раствор хлорида натрия.

Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.

Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа. Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.

Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.

Иммуноферментный анализ (ИФА) - наиболее распространенный современный метод, используемый для диагностики вирусных, бактериальных, протозойных инфекций. Модификаций ИФА очень много, но широко используется его твердофазный неконкурентный вариант. На 1-м этапе проводят взаимодействие антигена с антителами, на 2-м этапе образовавшийся иммунный комплекс обрабатывают антиим- муноглобулиновой сывороткой, меченной ферментом. Проявляют реакцию, добавляя субстрат для фермента, а затем - краситель-хромоген. При положительной реакции наблюдается изменение цвета раствора.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммуни­тета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворот­ке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реак­ции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при дей­ствии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) Обнаружение ан­тигена (рис. 20). Первый этап - адсорбция специ­фических антител на твердой фазе, в качестве которой используют по­листироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пла­стиковых панелей.

Второй этап - добав­ление исследуемого ма­териала, в котором пред­полагается наличие ан­тигена. Антиген связы­вается с антителами. После этого луночки промывают.

Третий этап - добав­ление специфической сы­воротки, содержащей антитела против данно­го антигена, меченые ферментом. В качестве фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Мече­ные антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом ма­териале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антнген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н₂О₂ в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, ин­тенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.