17Организация потока информации в клетке. История открытия нуклеиновых кислот. Доказательства роли днк как хранителя генетической информации. Свойства днк. Ауторепродукция днк.

История открытия нуклеиновых кислот: Открытие нуклеиновых кислот связано с именем молодого врача из города Базеля (Швейцария) Фридриха Мишера. После окончания медицинского факультета Мишер был послан для усовершенствования и работы над диссертацией в Тюбинген (Германия) в физиолого-химическую лабораторию, возглавляемую Ф. Гоппе-Зейлером. Пройдя практику по органической химии, Мишер приступил к работе в биохимической лаборатории. он получил из гнойных клеток вещество ядерного происхождения. Мишер был уверен именно в ядерном его источнике. он получил странное вещество. Оно не разлагалось протеолитическими ферментами, значит, не являлось белком. Отсутствие растворимости в горячем спирте указывало на то, что это вещество не являлось и фосфолипидом. В 1871 г. работа Мишера вместе с подтверждающими ее контрольными работами Гоппе-Зейлера и его ассистентов увидела свет. Вскоре методика Мишера была применена для выделения нуклеина из различных тканей. Термин «нуклеиновые кислоты» был предложен в 1889: нуклеиновыми они были названы потому, что впервые были открыты в ядрах клеток, а кислотами — из-за наличия в их составе остатков фосфорной кислоты. В конце XIX в. немецкий биохимик Альбрехт Коссель (1853-1927) расшифровал химический состав нуклеиновой кислоты, показав, что она содержит фосфорную кислоту, углевод и азотистые основания. В 1909 г. в результате гидролиза нуклеиновых кислот были выделены входящие в их состав сахара: рибоза и дезоксирибоза. В 1936 г. советский ученый А. Н. Белозерский впервые обнаружил ДНК в клетках растений. ДНК стали рассматривать как универсальный биологический материал. Со­глас­но ис­сле­до­ва­ни­ям нук­леи­но­вые ки­сло­ты со­сто­ят из С, H, O, P (8–10%) и N (15–16%). Ф. Левен, Д. Гулланд с сотрудниками (в цикле исследований, проведённых 1900-1932 гг.) установили, что фосфорная кислота, углевод и азотистое основание соединены в блоки в виде мономеров – нуклеотидов, расположенных вдоль линейной молекулы нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, выделенная из ядер клеток, в качестве углевода содержит D-дезоксирибозу. Поэтому она получила название дезоксирибонуклеиновой кислоты – ДНК. выделена цитоплазматическая нуклеиновая кислота, содержащая в качестве углевода D-рибозу; она получила название рибонуклеиновой кислоты – РНК. Доказательство роли ДНК как хранителя генетической информации: 1928г. Опыты Фредерика Гриффита. Объект патогенные бактерии, вызывающие пневмонию. Осуществляли инфицирование мышей указанными штаммами для того, чтобы понять различия между капсульным и бескапсульным вариантами. • В 1944 году Освальд Эйвери, Колин Мак. Леод и Маклин Мак Карти поставили перед собой цель - установить природу «трансформирующего» фактора. • Вместо убитых нагреванием целых клеток они предварительно разрушили их, т. е. взяли экстракт этих клеток. Полученный экстракт поочередно подвергли действию гидролитических ферментов, которые специфически разрушают определенные классы макромолекул – полисахариды, белки, липиды, РНК и ДНК. И затем изучили, при деградации каких макромолекул фактора исчезает трансформирующая активность клеточного экстракта. Вывод: трансформирующим фактором является ДНК. 1952г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз. вирусом, инфицирующим бактерию (кишечную палочку). фаговые частицы абсорбируются на наружной поверхности клетки, их материал проникает внутрь и примерно через 20 минут бактерия лизируется, освобождая большое количество фаговых частиц - потомков. В 1952 году после инфекции бактерии фагами, с помощью центрифугирования удалось выделить две фракции: пустые белковые оболочки фага и бактерии, инфицированных фаговой ДНК. Результаты этого эксперимента прямо показали, что ДНК родительских фагов проникает в бактерии и затем становиться составляющей развившихся новых фагов частиц. 1957г. Опыты Френкеля – Конрата. Френкель-Конрат работал с вирусом табачной мозаики (ВТМ). В этом вирусе содержится РНК, а не ДНК. Было известно, что разные штаммы вируса вызывают разную картину поражения листьев табака. После смены белковой оболочки "переодетые" вирусы вызывали картину поражения, характерную для того штамма, чья РНК была покрыта чужим белком. Следовательно, не только ДНК, но и РНК может служить носителем генетической информации. Свойства ДНК: Физико-химические свойства ДНК: • Растворы нативной ДНК вязкие из-за большого отношения длины молекулы к ее диаметру. • Благодаря азотистым основаниям ДНК поглощает свет в ультрафиолетовой области спектра. Поглощение для нативной двуспиральной ДНК на 40-50% меньше, чем поглощение смеси свободных нуклеотидов того же состава. Любое отклонение от двухспирального состояния сказывается в изменении величины этого эффекта. • Денатурация (плавление) ДНК – изменение пространственного расположения цепей ДНК без разрыва ковалентных связей, т. е. происходит расхождение цепей ДНК. за денатурацией ДНК можно наблюдать, оценивая ее гиперхромность, по величине которой можно судить о нативности ДНК. Денатурирующие агенты: высокая температура (выше 80˚С), радиация, ультрафиолетовое излучение, изменение pH и ионной силы раствора, тяжелые металлы. Денатурация ДНК обратима. При определенных условиях две разделенные комплементарные цепи могут восстановить двойную спираль. Это явление называется ренатурацией (отжиг). • Высокая реакционная способность. ДНК представляет собой сильную кислоту, таким образом, может образовывать прочные комплексы с положительно заряженными белками, ионами металлов. Репликация (редупликация, ауторепродукция) ДНК Репликация ДНК — процесс самоудвоения, главное свойство молекулы ДНК. Под действием ферментов молекула ДНК раскручивается, и около каждой цепи, выступающей в роли матрицы, по принципам комплементарности и антипараллельности достраивается новая цепь. в каждой дочерней ДНК одна цепь является материнской, а вторая — вновь синтезированной. Такой способ синтеза называется полуконсервативным. В репликации участвуют следующие ферменты:

• геликазы («расплетают» ДНК); дестабилизирующие белки; ДНК-топоизомеразы (разрезают ДНК); -ДНК-полимеразы (подбирают дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и комплементарно присоединяют их к матричной цепи ДНК); РНК-праймазы (образуют РНК-затравки, праймеры); ДНК-лигазы (сшивают фрагменты ДНК). Репликация протекает сходно у прокариот и эукариот. Репликация начинается одновременно в нескольких участках молекулы ДНК. Фрагмент ДНК от одной точки начала репликации до другой образует единицу репликации — репликон. SSB - белки – это белки, которые связываются с одноцепочечной ДНК и удерживают матрицу. В результате образуется репликативная вилка, где и происходит синтез новых цепей ДНК. Репликация происходит перед делением клетки. Благодаря этой способности ДНК осуществляется передача наследственной информации от материнской клетки дочерним. Этапы процесса репликации ДНК. Сначала молекула ДНК «расшнуровывается» — цепи молекулы расплетаются и расходятся направление синтеза. Синтез новой цепи начинается с 5’-конца, новые нуклеотиды присоединяются всегда к 3’-концевому нуклеотиду, к его свободной ОН-группе. При этом комплекс белков, синтезирующий ДНК, двигается вдоль матричной нити в направлении от 3' к 5', постепенно расплетая новые участки двойной спирали. Репарация («ремонт») Репарацией называется процесс устранения повреждений нуклеотидной последовательности ДНК. этапы: 1) ДНК-репарирующие нуклеазы распознают и удаляют поврежденный участок, в результате чего в цепи ДНК образуется брешь; 2) ДНК-полимераза заполняет эту брешь, копируя информацию со второй («хорошей») цепи; 3) ДНК-лигаза «сшивает» нуклеотиды, завершая репарацию. Наиболее изучены три механизма репарации: 1) фоторепарация, 2) эксцизная, или дорепликативная, репарация, 3) пострепликативная репарация. Репликация. Полимеризация дочерней ДНК на матрице ДНК приводит к ее удвоению или репликации. Синтез ДНК протекает в ядре в S-фазу клеточного цикла и предшествует делению клетки. Репликон – единица генома, в которой содержатся точка начала репликации – точка ori – последовательность ДНК, в которой инициируется процесс удвоения ДНК, и точка окончания репликации – сегмент ДНК, в котором процесс удвоения ДНК останавливается. У прокариот ДНК имеет форму кольца и содержит один репликон. У эукариот имеется большое число репликонов и репликация проходит одновременно на многих участках ДНК. Процесс синтеза ДНК включает стадии: инициации, элонгации и терминации. Этапы репликации у прокариот. Синтез ДНК у прокариот осуществляют ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза I, которая участвует в репликации и репарации; ДНК-полимераза II – вероятно, участвует в репарации; ДНК-полимераза III – основной фермент репликации.

Инициация репликации. Репликация начинается с расплетения двойной спирали ДНК и образования репликативной вилки. Это осуществляется при помощи ферментов хеликаз, которые перемещаются вдоль цепей ДНК и раскручивают их. Процесс расплетения двойной спирали ДНК является энергозависимым и требует затраты АТФ. Элонгация репликации. Субстратами для синтеза дочерних цепей являются четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (дНТФ): Синтез дочерних цепей ДНК идет в направлении 5’→3’ одновременно на обеих цепях матрицы ДНК. в 1960-х гг. Рейжи Оказаки экспериментально доказал, что синтез одной цепи ДНК происходит фрагментарно, прерывисто. Эти фрагменты были названы фрагментами Оказаки. цепь называется лидирующей.

Синтез второй цепи ДНК, которая называется Отстающей, также происходит от 5’- к 3’- концу, но в противоположном направлении репликативной вилки, инициируется многократно, т.о. синтезируется много праймеров и фрагментов Оказаки.

Этапы репликации у эукариот. Клетка эукариот содержит несколько ДНК-полимераз. 1 - Обладающие только полимеразной активностью: ДНК-полимераза α – находится в ядре, основной фермент репликации;

ДНК-полимераза β - локализована в ядре, является репарирующей ДНК-полимеразой;

ДНК-полимераза γ - осуществляет репликацию ДНК в митохондриях и хлоропластах;

2 - Обладающие полимеразной и 3’→5’-экзонуклеазной активностями: ДНК-полимераза σ - принимает участие в репликации отстающей цепи; ДНК-полимераза ε - принимает участие в синтезе лидирующей цепи ДНК.

Синтез ДНК начинается с образования праймера. Его образование катализирует праймаза – субъединица, входящая в состав ДНК-полимеразы α. Далее этот же фермент переключается на синтез ДНК и включает в синтезируемую цепь около 60 дезоксинуклеотидов, после чего заменяется другими ДНК-полимеразами. Продолжают синтез ДНК ДНК-полимеразы δ и ε, которые обладают экзонуклеазной активностью и в ходе синтеза могут отщеплять неправильно включенный нуклеотид. Это обеспечивает высокую точность синтеза ДНК. В отстающей цепи ДНК каждый фрагмент Оказаки содержит около 200 нуклеотидов, включающих РНК-праймер и участок ДНК. Праймер удаляется эндонуклеазой и РНКазой, а ДНК-полимераза β заполняет образующуюся «брешь» по принципу комплементарности, используя дНТФ в качестве субстратов . ДНК-лигаза объединяет фрагменты в полинуклеотидную цепь. Кофактором всех стадий репликации является ион Mg2+. По хромосоме эукариот в каждый момент времени независимо могут двигаться множество репликативных вилок. Остановка вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейся в противоположном направлении, или по достижении конца хромосомы. Процесс завершения слияния репликативных вилок можно считать терминацией репликации у эукариот. В результате вся ДНК хромосомы оказывается реплицированной. После деления каждая дочерняя клетка получает диплоидный набор хромосом, идентичный материнской клетке.