б) трепонемы

в) лептоспиры

– часто извитые формы имеют жгутики – фибриллярные образования из сократительных белков флагеллина. Жгутик фиксирован под клеточной стенкой в ЦПМ и обеспечив. активное движение бактерий.

33. Нагрузочные серологические реакции. Реакции непрямой гемагглютинации. Компоненты. Применение

Нагрузочные реакции иммунитета – реакции, в которых антиген нагружается на какой-либо носитель. В качестве носителя антигена используются эритроциты (РНГА), частицы латекса (латексная агглютинация), убитые микробные клетки (коагглютинация), частицы активированного угля (угольная конгламерация).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавливают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Адсорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома. Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества. Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов в исследуемом патологическом материале.

Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности. Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов).

Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора натрия хлорида. Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка.

РА используют для: 1) определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях; 2) определения возбудителя, выделенного от больного; 3) определения групп крови с использованием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специфическими антителами.

Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее. Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела

(агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка. Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум). Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

Механизм. Основан на том, что находящийся на поверхности золотистого стафилококка белок А селективно реагирует с Fc-фрагментом IgGl, G2, G4, оставляя свободными антидетерминанты Ат, которые, взаимодействуя с гомологичным Аг, вызывают агглютинацию стафилококков. Для постановки КОА применяют коммерческие стафилококковые реагенты, содержащиеся в ампулах или высушенные в лунках полистироловых пластин или предметных стекол. К реагенту добавляют 0,01- 0,1 мл исследуемой культуры или растворимого Аг, инкубируют при комнатной температуре 1030 мин (в условиях постановки реакции на стекле) или 18 -20 ч (в условиях постановки реакции в капиллярах). Учет проводят так же, как при обычной РА. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

34. Наследственность и изменчивость у бактерий. Механизмы обеспечения и передачи дочерним клеткам генетической информации. Механизмы изменчивости

Наследственный материал представлен:

А. Бактериальная хромосома:

•1 кольцевая молекула ДНК- E.coli, Shigella spp, P.aeruginosa

•2 кольцевые хромосомы - V. cholerae, L. interrhogans, Brucellas

•Линейные хромосомы- В. burgdorfeti,Streptomyces spp

Б. Плазмиды (кольцевая и линейная форма)

Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:

•устойчивость к антибиотикам;

•продукцию факторов патогенности;

•способность к синтезу антибиотических веществ;

•образование колицинов;

•расщепление сложных органических веществ;

•образование ферментов рестрикции и модификации.

Репликация может происходить как и независимо от хромосомы, так и сопряжено с репликацией хромосомы.

a)Интегративные/ эписома – плазмиды, обратимо выстраивающиеся в бактериальную хромосому.

b)Трансмиссивные (конъюгативные) – способны передаваться. Трансмессивность присуща плазмидам, имеющим tra-оперон, в котором объединены гены, ответственные за перенос плазмидыгены кодируют половые пили, которые образуют мостик с клеткой, не содержащей трансмиссивную плазмиду.

c)Мобилизируемы - Мелкие плазмиды, не несущие tra-гена, способны к передаче в присутствии в присутствии трансмиссивных плазмид, используя их аппарат конъюгации. Процесс – мобилизация.

d)R-плазмидой – плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерии к антибиотикам.

e) Плазмиды, детерминирующие синтез факторов патогенности, этиологическими агентами внутрибольничных инфекций.

В. Подвижные генетические элементы.

1. Вставочные (инсерционные)последовательности — IS-элементы — это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. IS-элементы содержат гены для их перемещения — транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента изДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения. Инвертированные повторы (сайты рекомбинации, окружающие вставочную последовательность) узнает фермент транспозаза, которая осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента.

Подвижные элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.

2. Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и ISэлементы, но имеющие в своем составе структурные гены, т.е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством. (токсичностью, устойчивостью к антибиотикам).

Г. Система интегронов.

- система захвата малых элементов ДНК, называемых генными кассетами, посредством сайтспецифической рекомбинации и их экспрессии.

Интегрон состоит из консервативного участка, расположенного на 5' конце, который содержит ген, кодирующий фермент интегразу, сайт рекомбинации att и промотор Р; на 3х’-конце – 1 ген антибиотикорезистентности и сайт рекомбинации.

Кассета может существовать в двух формах: линейной, когда кассета интегрирована в интегрон, и в виде маленькой кольцевой двухцепочечной ДНК.

За синтез факторов патогенности отвечают островки патогенности, которые имеют прямые повторы последовательностей ДНК или IS-элементы. Большинство островов патогенности локализовано на хромосоме бактерий (Salmonella), но также они могут находиться в составе плазмид (ShigeUa)и фаговых ДНК (V. cholerae01, 0139).

Механизмы обеспечения и передачи дочерним клеткам генетической информации.

1. Генетическая рекомбинация — это взаимодействие между двумя ДНК, обладающими различными генотипами, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК, сочетающей гены обоих родителей.

В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клеткиреципиенты, которые воспринимают его. В клеткуреципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, что приводит к формированию неполной зиготы — мерозиготы.

По молекулярному механизму генетическая рекомбинация у бактерий делится:

А. Гомологичная рекомбинация

-в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии.

- процесс под контролем генов REC-системы: генов recA, B,C,D – они расплетают нити ДНК, их переориентации с образованием полухиазмы, структуры Холидея, а также разрезают структуру Холидея для завершения процесса рекомбинации.

Б. Сайтспецифическая рекомбинация

Для протекания которой необходимы строго определенные последовательности ДНК и специальный ферментативный аппарат, которые специфичны для каждого конкретного случая.

Пример:

•встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными ISэлементами хромосомы и плазмиды,

•интеграция ДНК фага лямбда в хромосому Е. coli.

Сайтспецифическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участвует также в переключении активности генов.

Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгутикового Н-антигена.

В. Незаконная или репликативная рекомбинация

Незаконная или репликативная рекомбинация не зависит от функционирования генов гесА, В, С, D.

Пример: транспозиция подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами, что сопровождается репликацией ДНК.

Рекомбинация осуществляется 3мя механизмами:

1.Конъюгация

- передача генетического материала от клетки-донора в клеткурепипиент путем непосредственного контакта клеток.

Необходимым условием - наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды, которые кодируют половые пили, образующие конъюгационную трубочку между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по которой плазмидная ДНК передается в новую клетку.

Механизм передачи плазмидной ДНК: специальный белок, кодируемый tra-опероном, узнает определенную последовательность в ДНК плазмиды, вносит в эту последовательность одноцепочечный разрыв и ковалентно связывается с 5'-концом. Затем цепь ДНК, с которой связан белок, переносится в клетку-реципиент, а неразорванная комплементарная цепь остается в клетке-доноре. Клеточный аппарат синтеза ДНК достраивает одиночные цепи и в доноре, и в реципиенте до двухцепочечной структуры.

Белок,связанный с 5'-концом перенесенной цепи, способствует замыканию плазмиды в реципиентной клетке в кольцо.

Штаммы, в которых плазмида находится в интегрированном состоянии, переносят свои хромосомные гены бесплазмидным клеткам с высокой частотой и поэтому называются

Hfr.

Из-за хрупкости конъюгационного мостика половой фактор редко передается в клеткуреципиент, поэтому образовавшийся рекомбинант донорскими функциями, как правило, не обладает.

2.Трансдукция

-передача бактериальной ДНК посредством бактериофага.

В процессе репликации фага внутри бактерий фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится в реципиентную бактерию во время фаговой инфекции.

Типа трансдукции:

a) общая трансдукция — перенос бактериофагом сегмента любой части бактериальной хромосомы — происходит вследствие того, что в процессе фаговой инфекции

бактериальная ДНК фрагментируется, и фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую головку, формируя дефектную фаговую частицу и рекомбинирует гомологичной рекомбинацией с гомологичным участком хромосомы-реципиента с образованием стабильного рекомбинанта. Этим типом трансдукции обладают Р-фаги.

b) Специфическая трансдукция наблюдается в том случае, когда фаговая ДНК интегрирует в бактериальную хромосому с образованием профага. В процессе исключения ДНКфага из бактериальной хромосомы в результате случайного процесса захватывается прилегающий к месту включения фаговой ДНК фрагмент бактериальной хромосомы, становясь дефектным фагом. Так как большинство умеренных бактериофагов интегрирует в бактериальную хромосому в специфических участках, для таких бактериофагов характерен перенос в клетку-реципиент определенного участка бактериальной ДНК клетки-донора. ДНК дефектного фага рекомбинирует с ДНК клеткиреципиента сайт-специфической рекомбинацией. Рекомбинант становится меродиплоидом по привнесенному гену. В частности, бактериофаг передает специфической транедукцией gal-ген у Е.coli.

3.Трансформация

превращение бескапсульного R-штамма пневмококков (Streptococcus pneumoniae) в штамм, образующий капсулу S-формы.

Процесс может происходить самопроизвольно, когда ДНК, выделенная из погибших клеток, захватывается реципиентными клетками (В. subtilis, И, influenzae, S. Pneumoniae).

Процесс трансформации зависит от компетентности, способности бактериальной клетки поглощать ДНК. У грамположительных бактерий компетентность связана с

определенными фазами кривой роста, а у грамотрицательных компетентность приходится создавать искусственным путём, подвергая бактерии температурному или электрошоку.

Трансформирующей активностью обладает только двунитевая высокоспирализованная молекула ДНК, так как в то время как 1 нить ДНК проникает в клетку-реципиент, вторая подвергается деградации с высвобождением энергии, необходимой для проникновения. Рекомбинация происходит на одной нити, в результате чего образуется гетеродуготексная молекула, одна нить которой имеет генотип реципиента, а другая — рекомбинантный генотип.

Трансформация – метод генной инженерии.

Мутации:

— это изменения в последовательности отдельных нуклеотидов ДНК, которые фенотипически ведут к таким проявлениям, как изменения морфологии бактериальной клетки, возникновение потребностей в факторах роста.

•Прямая мутация – мутации, приводящие к потере функции;

•Реверсия – м., приводящие к восстановлению исходных свойств.

o Обратная/прямая реверсия – восстановление генотипа и фенотипа; o Супрессорная – восстановление только фенотип;

По протяженности изменений повреждения ДНК различают:

Точечные – повреждение пары нуклеотидов Протяженные/ аберрации

o выпадение нескольких пар нуклеотидовделеция; o Добавление нуклеотидными пар – дупликация;

o Перемещение фрагментов хромосомы – транслокации; o Перестановки нуклеотидный пар – инверсии.

По причине возникновения:

Спонтанные – вследствие перемещения подвижных генетических элементов.

Индуцированные – под влиянием внешних факторов, мутагенез (химических, биологических -транспозоны, физических)

Замена пурина другим пурином, а пиримидина другим пиримидином называется транзицией.

Типы репарации:

•На свету – связан с деятельность фотореактивирующегося фермента, который расщепляет тиминовый димер.

•При темновой репарации дефектные участки цепи ДНК удаляются и образовавшаяся брешь достраивается при помощи ДНК-полимеразы на матрице сохранившейся цепи и соединяется с цепью лигазой.