24. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. МПК (МИК) и МБК. Критерии определения бактериальных изолятов как чувствительные, устойчивые, умеренно чувствительные

МПК – минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде.

МБК – минимальная бактерицидная концентрация – минимальная концентрация антимикробного препарата, вызывающая при исследовании in vitro полную гибель бактерий в стандартных условиях опыта.

Хорошие лекции:

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

Определение чувствительности выделенных культур возбудителя к антибиотикам, является необходимым элементом бактериологического исследования и обязательным условием антибиотикотерапии.

А. Метод стандартных бумажных дисков.

Величины зон задержки роста:

·диаметр от 0 мм до 6 мм – устойчивые;

·диаметр от 7 до 15мм – слабочувствительные;

·диаметр от 16 мм до 24 мм – чувствительные;

·диаметр от 25 мм и более – высокочувствительные.

Метод дает только качественную характеристику, однако прост и доступен в исполнении.

Б. Метод серийных стандартных разведений – позволяет определять минимальную подавляющую (ингибирующую) концентрацию антибиотика.

В. Экспрессный рэдокс-метод – основан на улавливании изменения ОВП питательной среды микроорганизмами по изменению цвета индикатора, добавленного в питательную среду (подолжительность определения 3-5 часов).

Д. ПЦР – выявление у микроорганизма генов устойчивости.

Г. Е-тест – применяют бумажные полоски, пропитанные рядом убывающих концентраций определённого антибиотика (128, 64, 32, 16, 8... мкг/мл), после инкубирования вокруг полоски образуется эллипсовидная зона задержки роста.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБИОТИКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

Для определения концентрации антибиотиков в моче, крови и других биологических жидкостях используют метод, основанный на способности антибиотиков диффундировать в агар, зараженный тестмикробом и подавлять рост последнего. Зона подавления роста тест-микроба зависит от концентрации

антибиотика в изучаемом субстрате. Диаметры полученных зон сравнивают с величиной зон, образующихся при нанесении на агар известных количеств стандартного препарата (стандартами служат специально приготовленные очищенные образцы антибиотиков, активность которых установлена по международным стандартам).

Зверев:

Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:

•Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качественный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

•Методы определения минимальных ингибирующих (МИК) и бактерицидных концентраций (МБК), т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов. Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

·Молекулярно-генетические методы (ПЦР и др) позволяет исследовать геном микробов и обнаружить гены резистентности

·Метод пограничных значений (мудл)

·Метод разведений в жидкой среде (мудл)

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков.

Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с инструкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня.

По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов.

Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин).

Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность микроорганизмов методом серийных разведений.

Мудл:

После наложения диска на засеянную "газоном" культуру начинается диффузия препарата в агар, при этом его концентрация в агаре уменьшается по мере удаления от диска. Испытуемая культура может расти на агаре только там, где концентрация антибиотика не подавляет ее роста. Вокруг диска образуется зона задержки роста, коррелирующая с устойчивостью (чувствительностью) штамма к препарату.

Диаметры зон задержки роста содержатся в оценочных таблицах и позволяют разделить штаммы на чувствительные (S), устойчивые (R) и промежуточные (I).

Достоинства метода

·Простота постановки теста и учета результатов

·Низкая стоимость

·Доступность для любой диагностической лаборатории

Недостатки

·Результат носит качественный характер

·Может быть использован не для всех препаратов (особенности диффузии некоторых препаратов

вагаре)

·Большое влияние "человеческого фактора" на конечный результат

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.

Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий.

Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе.

Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106—107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры).

Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры.

Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

Кчувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.

Кумеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.

Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Посев испытуемых культур производят на чашки с различными концентрациями антибиотика. После инкубации определяют минимальную концентрацию препарата, при которой подавляется рост штамма - минимальная ингибирующая концентрация (МИК). (мудл)

Достоинства метода

·Количественная характеристика резистентности

·Возможно отслеживать нарастание резистентности в популяции микроорганизмов

·Одномоментное определение резистентности большого количества штаммов к большому количеству препаратов (при использовании штампа-репликатора)

Недостатки метода

·Высокая трудоемкость, большой объем подготовительной работы.

·Не удобен для работы с единичными штаммами