1.6. Минеральные соли

Готтшалк Г. (1982) выделяет 10 химических элементов, тре­буемых для микроорганизмов в высоких концентрациях (С, О, Н, N,S, Р, К,Mg,Ca,Fe), минорные незаменимые элементы (Zn,Mn) и ряд элементов, необходимых только для отдельных

20

21

микроорганизмов с особым типом метаболизма (Se,Mo,Co,Cu,W).

Соли кальция и магния могут изменять чувствительность ми­кроорганизмов к антибиотикам (Чайковская С. М. и соавт., 1981).

Подробный анализ лимитирования и ингибирования жизне­деятельности микроорганизмов ионами металлов (Fe,Ca,Mg, Мп) дали Мельникова В. А. и соавт. (1991).

Показана высокая чувствительность бактерий рода Pseu-domonas к солям Ва²⁺ (Сиволодский Е. П., 1988; Смирнов В. В., Киприанова Е. А., 1990). Угнетающее действие ионов бария ос­лабляется или устраняется ионами кальция и магния (но не мар­ганца, кобальта, молибдена, меди и железа). Предполагается, что ионы бария являются антагонистами некоторых дивалентных катионов, играющих важную роль в стабилизации наружной мембраны.

Mustafa R, Whittenbury A. (1970) показали устойчивость ряда фитопатогенных псевдомонад, в отличие от флуоресцирующих сапрофитов, к солям марганца и чувствительность к солям ко­бальта.

В состав среды для Ps.aeruginosa, разработанной в НИИ эпи­демиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва), вхо­дят минеральные соли магния, калия (Мороз А. Ф. и соавт., 1976). Ионы К* облегчают образование у данных микроорганиз­мов пигментов (Якубчак О. Н., 1997). Для образования бактери­альных белков необходимы анионы, содержащие серу. По этойпричине в среды для Ps. aeruginosa вводят K2SO4 в диапазоне кон­центраций от 7 (селективная среда РЧЖ)—8 г/л (средаPFA—Gill У, Stock E, 1987)—до 10 г/л (среда Кинга A); MgSOo—в диапа­зоне от 0,2 (среда с ацетамидом) и 0,5 г/л (среда Паллерони-Дау-дарова) до 1,5 г/л (среды РЧЖ и Кинга В). В селективную средудля Ps. aeruginosa Федориной А. П. (1987) входит 0,22—0,66 мг/мл сульфата цинка. Ряд неорганических солей содержит среда куль­тивирования Аджиевой А. А. и соавт. (1987). Содержание КгНРСЬ колеблятся в диапазоне от 0,3 (среда Хью-Лейфсона) до 1 (среда с ацетамидом) и 1,5 г/л (среда Кинга В).

По данным Tzouvelekis L. et al. (1990) недостаток Mg стимули­ровал продукцию белка HI всеми штаммами Ps. aeruginosa и сни­жал уровень синтеза ЛПС без изменения качественного состава последних. Выращенные наMg-дефицитной средеPs.aeruginosaпроявляли повышенную чувствительность к сыворотке, расход Сз-компонента комплемента был снижен. Кроме указанногоMgSOi, в среды в качестве соединения, содержащего ионы Mg²⁺, вводят MgCb в количестве 1,4 г/л (цетримидный агар, среда Кин­га А) и 1,5 г/л (среда РЧЖ). По Blumentals J. et al. (1987) добавле­ние в среду культивирования MgSO-t, ZnSO и CuSOi не влияло на синтез экзотоксина Ps. aeruginosa. Ионы Fe²⁺ тормозили, а ионы Са²⁺усиливали синтез экзотоксина А, причем повышение кон-

22

центрации Са²⁺ с 25 до 500 мМ увеличивало выход экзотоксина как минимум в 3 раза. Добавление в среду СоСЬ снижало выход экзотоксина на 60%. В состав сред Хью-Лейфсона, МакКонки и среды с ацетамидом входитNaClв количестве 5 г/л.

Кулаев И. С. и соавт. (1987) отмечают отрицательное влияние на синтезPs.lyticaфермента, обладающего бактериологической активностью в отношении ряда грамположительных микробов, некоторых солей в концентрациях, используемых обычно для приготовления питательных сред.

Вульфдитер Ш., Петер К. (1992) предлагают для получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы культивировать соответству­ющие микроорганизмы—продуценты из рода Pseudomonas(Ps.putida) на питательной среде, содержащей минеральные со­ли—сульфат магния, фосфаты натрия двузамещенного и калия однозамещенного, а также соединения железа и хлора.

Марцинкявичене Л. Ю. и соавт. (1991) отмечают повышение активности и чистоты холестеринэстеразы при культивировании его продуцента—Ps. mendocina ВКПМ В-2173 на среде, содержа­щей 0,5—2,5 г/л фосфата калия двузамещенного; 0,5—0,8 г/л се-миводного сульфата магния; 0,3—0,8 г/л хлорида калия и 1—3 г/л нитрата натрия.

По данным Бойкова Ю. Н. и соавт. (1991) выход и активность рестриктазыPsu1 возрастают при культивированииPs.stutzeriВКПМ В-4724 в питательной среде, содержащей 1—2 г/л сульфа­та аммония; 0,5—0,7 г/л цитрата натрия и 0,001—0,002 г/л хлори­да железа.

Иванов Ф. М. (1967) разработал полужидкую обогатительную среду, в состав которой входили 2 г/л фосфата натрия однозаме­щенного; 2 г/л цитрата натрия и 0,6 г/л гипосульфита.

Maudsley J., Kadis S. (1986) разработали синтетическую среду для культивирования гемолитически активных бактерий Н.pleu-ropneumoniae. Несмотря на снижение ростовых свойств, концен­трация внеклеточного гемолизина на ней была в 8—10 раз выше, чем на среде с соевым гидролизатом и 0,6% дрожжевого экстрак­та, а также бульоне на сердечной вытяжке (контрольные среды). Продуцируемый гемолизин является термолабильным белком, активность которого зависит от концентрации в среде ионов же­леза в определенных фазах роста бактериальных культур.

Vanden В. (1987) на основании значительного улучшения ро­стовых свойств среды для 19 испытанных штаммов Н. ducreyi при добавлении 0,01 мкг/мл селенита натрия сделал предположение о влиянии на высеваемость этого микроорганизма неодинаково­го количества селена в образцах крови, сыворотки и воды, ис­пользуемых для приготовления сред.

WootenJ.etal. (1987) показали использование в качестве ис­точников железа бактериями Н.influenzaeгема, гемоглобина, миоглобина, гемоглобин-гаптоглобина и насыщенного на 30% человеческого трансферрина, но не лактоферрина.

23

PidcockK.etal. (1988) на определенной среде с ограничен­ным содержанием железа изучали влияние гемина и других (не из крови) источников железа на рост Н.influenzaeтипаbи нети-пируемых штаммов. Использовали железо из гемина, гемоглоби­на, гемоглобин-гаптоглобина, гемин-гемопексина. Рост усили­вался частично очищенным человеческим трансферрином, но не лактоферрином или ферритином. Очищенный ферриентерохо-лин и ферридесферриоксамин не влияли на рост этого микроба.По данным Gorringe A. et al. (1991) при дефиците железа в ро­стовой среде у Bord. pertussis и Bord. parapertussis появляются но­вые мембранные белки и сидерофоры, обеспечивающие перенос ионов железа с трансферрина бактериальной клетке.

В низких концентрациях бикарбонат натрия стимулировал, а более высоких—ингибировал размножение мелких спирохет (FiehnN.-E., 1989).

Малахов Ю. А. (1992) рассматривает потребность лептоспир в минеральных солях—источникахMg,Ca,Mn,Fe,Zn, К.

В качестве селективной при исследовании загрязненных проб используется среда с мочевиной и солями кобальта (Росто-мянС. В., 1973).

Для дифференциации лептоспир наибольшее применение нашел бикарбонатный тест: патогенные лептоспиры, в отличие от сапрофитных, не растут на средах с NaHCO. Используютсятакже тесты со средами содержащими соли меди, сулемы, лития, нитрата кобальта и серебра (Троп И. Е., Бутакова А. Е., 1976).DaokG.etal. (1961) изучали питательную потребность Т.pal­lidumв дивалентных ионах.

PekalaD.,PadgettP. (1986) исследовали рост и микроаэро-фильную природу видовBorreliaпри культивировании в среде А с добавлением соединений, детоксицирующих супероксидные и гидроксильные радикалы, перекись водорода, атомарный кисло­род. Из испытанных диметилсульфоксида, формата натрия, ман-нита, дитиотреитола и активированного угля, первые два оказа­лись наиболее эффективными стимуляторами роста боррелий. Хороший результат получен также при комбинации хлорида же­леза и метабисульфита калия в концентрации 0,002%.

По данным SarafianS.,MorseS. (1986) продукция токсина-1 синдрома токсического шока шт.St.aureus1169 в синтетической безуглеводной среде возрастает при увеличении концентрацииионов Mg²⁺ до 2,0 мМ, а при дальнейшем увеличении концентра­ции—снижается. В анаэробных условиях концентрация ионовMg²⁺ не влияла на синтез токсина. Между тем, отмечается неза­висимость процессов синтеза токсина и роста микроорганизмов друг от друга.

Несколько иные результаты получены TaylorD.,HollandК.(1988), наблюдавших в условиях дефицита ионов Mg²⁺ (100 мкМ) заметное снижение скорости роста популяцииSt.aureusи про­дукции токсина по сравнению с культурой, выращиваемой при

24

избытке ионов Mg²⁺ (1 мМ). Использовалась синтетическая сре­да, в состав которой входило 6 аминокислот, глюкоза, 2 витами­на и соли.

James J. et al. (1989) также изучали влияние магния на продук­цию in vitro токсина-1 St. aureus. Предварительно выращенные на триптиказо-соевом агаре колонииSt.aureusсуспендировали всреде без Mg²⁺ и после отмывания инкубировали в синтетической среде с Mg²⁺ в концентрации от 4,6 мМ до 0,033 мкМ при ограни­ченном содержании либо валина, либо триптофана, в аэробныхи анаэробных условиях. Mg²⁺ влиял на размножение St. aureus и продукцию ими токсина-1. Специфическая активность токси­на-1 увеличивалась с ростом концентрации Mg²⁺ и была макси­мальной при физиологических уровняхMg²⁺. При анаэробных условияхSt.aureusросли, но не продуцировали токсин-1. В фер­ментере при содержании валина в среде не более 10 мкг/мл его продукция и специфическая активность повышались с уменьше­нием концентрации триптофана, независимо от концентрацииMg²⁺ в среде. Таким образом, не удалось подтвердить предполо­жение о специфическом контролирующем действииMgна про­дукцию токсина-1St.aureusinvitro.

Bhat К. et al. (1994) установили необходимость для начала ро­ста St. aureus не менее 0,01 мМ Mg²⁺ в среде и усиление роста при увеличении его концентрации до 1,6 мМ. Причем от содержания этого иона в среде зависят утилизация глюкозы, кислотный син­тез, и он мог снижать ингибиторный эффект избыточного содер­жания Со иZnна ростSt.aureus.

YabuК. (1986) разработал эффективный метод полученияL-формSt.aureusпри 30°С в инкубационной жидкой среде, со­держащей осмотические протекторы (сульфат магния, хлорид натрия) в сочетании сL-трансформирующими агентами.

Для развития самых различных видов бактерий в деминера­лизованной синтетической среде требуется от 0,3 до 4 мМ желе­за (DhopleA.etal., 1996). Одним из его источников в среде куль­тивирования является сыворотка крови.

Известна непосредственная связь патогенности микроорга­низмов с их способностью усваивать железо из организма хозя­ина, основными источниками которого являются белки лакто-феррин и трансферрин. Большинство бактерий для утилизации железа синтезируют специальные, обладающие высоким срод­ством к нему, низкомолекулярные соединения—сидерофоры. Виды патогенных бактерий способные утилизировать железо непосредственно из лактоферрина и трансферрина без предва­рительного синтеза сидерофоров единичны—это N. gonor­rhoeae, N.meningitidisи Н.influenzae. Кроме того, в качестве не-сидерофоробразующих отмечаются М.pneumoniae,TrichomonasvaginalisиBacteroidesfragilis. Перечисленные нейссерии могут использовать в качестве источника железа только определенный тип трансферрина, а именно человеческий. Механизм усвоения

25

железа несидерофоробразующими бактериями мало изучен. Предполагается, что для нейссерий основной стадией утилиза­ции железа является биосинтез специфических железорегулиру-ющих белков-рецепторов, интенсивно синтезируемых в услови­ях дефицита железа в среде культивирования (Филатова Т. Н. и соавт., 1995).

В плотных средах для L. pneumophila оптимальное содержание пирофосфата железа равно 0,25 г/л, тогда как в жидких его кон­центрация может быть уменьшена (Ristoph J. et al., 1981; Warren W, Muller R., 1981) или же этот компонент вообще может отсутство­вать (Костюченко В. И. и соавт., 1985). СолиNaCl,MgSO,Ca(NCb)₂, (NH4)₂S04, Fe4(P₂07)₃ в концентрациях 10-50 мг/л не­значительно стимулируют рост L. pneumophila и продукцию им термолабильного токсина, тогда какNaHCChв количестве до 100 мг/л не влиял,aZnS04 и МпСЬ уже в концентрациях 20 и100 мг/л, соответственно, подавляли оба процесса (Белый Ю. Ф. и соавт., 1986).

Рублевым Б. Д. и соавт. (1988) показана возможность ограни­чения роста бактерий чумы уровнем содержания железа в пита­тельной среде. Вирулентные штаммы обладали более выражен­ным механизмом ассимиляции его по сравнению с вакцинным. Ионы железа извлекаются при контакте поверхности клеток с железонасыщенным трансферрином.

Esteve С, Amaro С. (1991) изучали образование сидерофоров у Aeromonas spp. выделенных от европейского угря. Условия с огра­ниченным содержанием железа получали добавлением хелатных соединений, содержащих железо (ЭДДА). Минимальные ингиби-торные концентрации (MlС) ЭДТА и образование сидерофоровбыли продемонстрированы на хром-азурол-S (CAS)-arape. Все ис­следованные штаммы были способны расти при низком содержа­нии железа. Хелатные типы сидерофоров производили все виды и были функционально связаны с энтеробактином.

Simpson L. (1987) изучала способность V. vulnificus компенси­ровать недостаток железа использованием связывающих этот элемент белков. Изученные штаммы не были способны извле­кать железо из недостаточно насыщенных им лактоферрина илиферритина, при полном же насыщении железом этих белков рост бактерий усиливался. Ни один штамм не усваивал железо из 30% насыщенного трансферрина, но они различались по способно­сти усваивать его из полностью насыщенных форм. Вирулент­ный штамм, в отличие от авирулентного, более эффективно ис­пользовал трансферрин при условии полного насыщения его же­лезом.

Минимальное количество железа, необходимое для полного роста микобактерий, колеблется в пределах 1—4 мМ. Dhople A. et al. (1996) связывают интенсивность роста М. avium с уровнем на­сыщения трансферрина железом: высокое содержание железа стимулирует рост данного микроорганизма.

Предполагается регулирующая роль кальция в разнообраз­ных внутриклеточных процессах у прокариот, в том числе в раз­витии, дифференциации и споруляции у актиномицетов (Ивано­ва И. В. и соавт., 1994; Daza A. et al., 1989; Natsume M., 1989). Инициирование спорообразования объясняют нарушением кальцием внутриклеточного фосфатного равновесия в сторону снижения по причине образования нерастворимых фосфатов кальция. Эффективность влияния кальция зависит от концент­рации его свободных ионов, вследствие чего в связанном виде, например в форме карбоната, он практически не воздействует на дифференциацию актиномицетов (Иванова И. В. и соавт., 1994). Биологическое действие кальция основано на его структурных свойствах, благодаря которым он способен связываться с боль­шими полимерными молекулами, а также образовывать компле­ксы с низкомолекулярными анионами и нейтральными лиганда-ми (KazmierczakJ., 1986).

По данным Волковой В. П. и соавт. (1985) из минеральных солей наиболее способствуют споруляции В. anthracisсоедине­ния магния и марганца, причем последний обладает подобным эффектом и относительно многих других видов бациилл (HodgesN.,BrownR., 1974;OhYoung,FreeseE., 1976; Перт, 1978; Смирнов В. В. и соавт., 1982).

EdwardsR.etal. (1997) показали влияние ионов цинка на ак­тивность металло-р-лактамаз уBact.fragilis. Наибольшая актив­ность фермента отмечалась при концентрации сульфата цинка 50—500 мкМ. ДобавлениеZnв среду увеличивает образованиеCdS-частиц, определяющих токсичность К1.pneumoniae(Hol­mesJ.etal., 1997).

Отмечается увеличение токсичности ионов Znхлоридом на­трия,Sn—агар-агаром и уменьшение токсичностиCdхлоридом натрия,Sn,Cd,Pb,NiиZn—силикагелем,Cdи РЬ—фосфата­ми,Pb—карбонатами. Ингибиторными свойствами обладает комплекс меди с пептоном (BridsonE.,BreckerА., 1970). Кожо-карь Э. И. и соавт. (1991) предлагают в качестве ингибитора со­путствующей микрофлоры при выращивании грибов использо­вать 0,55—0,76 г/л хлорида кадмия.

По Zaika L. et al. (1997) добавление поливалентных ионов ме­таллов в среду культивирования L. monocytogenes, например сре­дуBHI, содержащую полифосфат натрия предотвращало инги-бирующее действие последнего на данный микроорганизм.