Контрольные вопросы

1. Что такое клеточная стенка?

2. В чем различия в клеточных стенках грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов?

3. Приведите примеры прокариот без клеточной стенки, с необычными клеточными стенками;

4. Перечислите методы изучения клеточной стенки бактерий;

5. В чем заключается суть окраски по Граму?

Лабораторная работа № 6 методы изучения подвижности бактерий

Цель работы: Изучить способность бактерий к движению, разобрать строение жгутика и типы жгутикования, отработать способы окраски жгутиков.

Оборудование, материалы: 12-16 часовая бульонная или 1,5 % агаровая культура подвижных бактерий, скошенный РПА, бактериологические петли, предметные стекла, спиртовка, иммерсионное масло, световой микроскоп, дистиллированная вода, воронка с фильтром, набор красителей (протрава, разбавленный фуксин Циля, жидкость Руге, аммиачный раствор серебра).

Теоретические сведения

На клеточной поверхности многих прокариот имеются струк­туры, определяющие способность клетки к движению в жидкой среде. Это — жгутики. Их число, размеры, расположение, как пра­вило, являются признаками, постоянными для определенного вида, и поэтому учитываются при систематике прокариот. Однако накапливаются данные о том, что количество и расположение жгутиков у одного и того же вида могут в значительной степени определяться условиями культивирования и стадией жизненного цикла, и, следовательно, не стоит переоценивать таксономиче­ское значение этого признака.

Если жгутики находятся у полюсов или в полярной области клетки, говорят об их полярном или субполярном расположении, если вдоль боковой поверхности, говорят о латеральном располо­жении. В зависимости от числа жгутиков и их локализации на по­верхности клетки различают монополярные монотрихи (один жгу­тик прикреплен к одному полюсу клетки), монопо­лярные политрихи (пучок жгутиков расположен на одном полюсе клетки), биполярные политрихи (на каждом полюсе — по пучку жгутиков) и перитрихи (многочисленные жгутики расположены по всей поверхности клетки или вдоль ее боковой поверхности (Рис. 16). В последнем случае число жгутиков может достигать 1000 на клетку.

Рис. 16. Типы жгутикования у бактерий: 1 — монотрихиальное; 2 — лофотрихиальное; 3 — латеральное: 4 — амфитрихиальное; 5 — перитрихиальное; 6 — «смешанное» полярно-перитрихиальное.

Обычная толщина жгутика — 10—20 нм, длина — от 3 до 15 мкм. У некоторых бактерий длина жгутика может на порядок превышать диаметр клетки. Как правило, полярные жгутики бо­лее толстые, чем перитрихиальные. Жгутик представляет собой относительную жесткую спираль, обычно закрученную против ча­совой стрелки. Вращение жгутика также осуществляется против часовой стрелки с частотой от 40 до 60 об/с, что вызывает враще­ние клетки, но в противоположном направлении. Поскольку клетка намного массивнее жгутика, она вращается со значительно меньшей скоростью — порядка 12—14 об/мин. Вращательное движение жгутика преобразуется также в поступатель­ное движение клетки, скорость ко­торого в жидкой среде для разных видов бактерий составляет от 16 до 100 мкм/с.

Бактериальные клетки со жгу­тиками двигаются со скоростью, которая зависит от особенностей их аппарата движения и свойств среды — вязкости, температуры, рН, осмотического давления и др. Большинство бактерий за се­кунду проходят расстояние, равное размерам их клетки. Однако некоторые бактерии при благоприятных условиях за то же время могут передвигаться на расстояние, превышающее размеры клет­ки в 50 раз и более. Жгутики хорошо видны в электронном микроскопе, для наблю­дения через оптический микроскоп требуется их специальная обработка. Жгутики не относятся к жизненно важным структурам бактериальной клетки. Так, бак­терии, обладающие жгутиками, можно вырастить в условиях, при которых эти структуры у них не развиваются. У подвижных бак­терий наблюдаются «фазовые ва­риации», то есть в течение одной фазы развития жгутики имеются, в другой — отсутствуют. Жгутики можно разрушить, а клетка оста­нется жизнеспособной.

Жгутик (рис. 17 и 18) состоит из базального тела, включающего че­тыре (у грамотрицательных) или два (у грамположительных бак­терий) кольца, стержень и моторные белки, а также из крючка и филамента. Базальное тело закреплено в ЦПМ двумя кольцами М и S, которые часто рассматривают как одно целое. MS-кольцо окружено несколькими белками, которые называют моторными и от которых вращающий момент передается на филамент. В пептидогликановом слое периплазмы у грамотрицательных бакте­рий находится кольцо Р, а во внешней мембране — кольцо L. Оба эти кольца выполняют роль втулки, дополнительно удержи­вающей механизм жгутика. Вес кольца пронизаны жестким стер­жнем, который передает крутящий момент. На наружной сторо­не ВМ механизм жгутика имеет крючок, переходящий затем в филамент, который заканчивается «шапочкой». Филамент представляет собой ригидный цилиндр, состоящий из простого бел­ка флагеллина. Молекулы флагеллина переносятся к месту удлинения филамента через узкий канал внутри него. Mot-белки действуют как «мотор» жгутика, вращая жесткий стержень жгутика, который передает крутящий момент на внешнюю часть жгутика через крючок, двигая клетку во внешней среде, тогда как Fil-белки выполняют роль «выключателя двигателя».

Рис. 17. Схема структуры жгутика прокариот на примере грамотрицательных бактерий.

Рис. 18. Строение жгутика грамотрицательных (А) и грамположительных (Б) бактерий

Синтез жгутика (рис. 19) начинается с появления MS-кольца в ЦПМ, с последующим прикреплением к нему моторных белков, Р- и L-колец (у грамотрицательных бактерий), крючка и «шапоч­ки», которая прикрывает полый цилиндр начавшего строиться филамента с верхнего конца. Если бы этой структуры не суще­ствовало, то синтезируемые на рибосоме субъединицы белка-флагеллина, подающиеся к вершине филамента через полое внутрен­нее пространство базального тела и самоорганизующиеся по спи­рали, пропадали бы в окружающей среде. Таким образом, при синтезе и удлинении филамента белки «шапочки», действуя на­подобие своеобразных шаперонов, помогают собираться флагеллину в равномерно растущую структуру. Для сборки одного филамента необходимо около 20 тыс. молекул флагеллина. Синтез жгутика кодируется более чем 30 генами, при этом неизвестно, ка­ким образом определяется точное местоположение закладки жгутика.

Рис. 19. Последовательность событий при биосинтезе жгутиков.

Рис. 6. Капсулы у Bacillus niegalc-rium (X 2160) (по С. Робиноу).

Практическая часть

Существует несколько способов окраски жгутиков. Все они ос­нованы на использовании различных протрав, осаждающихся на поверхности жгутиков, благодаря чему диаметр жгутиков увели­чивается и они становятся видимыми в световом микроскопе. Ок­раска жгутиков требует тщательной подготовки клеток и аккуратности в работе, так как жгутики легко обламываются даже при легком взбалтывании суспензии.

Окраска жгутиков по методу Леффлера в модификации Пешкова. Бактерии, предназначенные для окраски жгутиков, ежедневно в течение 2—3 дней пересевают в свежую жидкую или на плотную среду, содержащую не более 1,5% агара. Для окраски жгутиков используют клетки 12—16-ча­совой культуры. Клетки осторожно берут петлей и переносят в пробирку со стерильной водой, подогретой до температуры, при которой их выращивали. Прежде чем делать мазок, каплю полу­ченной суспензии просматривают под микроскопом и убеждаются в том, что клетки подвижны и плотность суспензии невелика — 5—10 клеток в поле зрения.

Клетки легко теряют жгутики в момент приготовления мазка, поэтому необходимо обращать внимание на чистоту стекла и спо­соб нанесения на него суспензии. Предметные стекла должны быть тщательно обезжирены. Непосредственно перед приготовле­нием мазка стекло 3—4 раза проводят через наиболее горячую часть пламени горелки. Дают стеклу остыть и пастеровской пи­петкой или петлей наносят 3—4 маленькие капли на стекло. Кап­ли должны хорошо расплываться по стеклу и быстро высыхать. Высушенный мазок заливают протравой. Необходимо следить, чтобы протрава не подсыхала. Через 15 мин протраву смывают дистиллированной водой и препарат окрашивают в течение 5 мин разбавленным фуксином Циля, погружая его мазком вниз в раст­вор красителя. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют с иммерсионной системой. Обращают внимание на расположение жгутиков, их количество и длину.

По методу Рыжковой препарат заливают протравой через во­ронку с фильтром и трижды в течение 3—5 мин подносят стекло к пламени горелки до появления паров. Затем протраву сливают и препарат заливают через воронку с фильтром раствором Циля на 5—10 мин.

Окраска жгутиков по способу Фонтана. Для окраски жгутиков используют клетки 12—16-часовой культуры, выращенной на скошенной агаризованной среде с конденсацион­ной водой. Культуру вынимают из термостата и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. В пробирку с 0,5 мл водопроводной стерильной воды вносят клетки, взятые на границе с конденсаци­онной водой. Материал берут осторожно, следует только коснуть­ся бактериологической петлей поверхности культуры. Петлю с бактериальной массой оставляют в воде на 1 ч. За это время подвижные бактерии окажутся свободно взвешенными в воде. За­тем петлю вынимают, прокаливают, охлаждают и только после этого ею берут капли взвеси бактерий и осторожно наносят их на обезжиренное стекло. Нанесенные капли не размазывают, они должны быстро высохнуть, лучше в термостате. Мазки фиксиру­ют 5 мин жидкостью Руге. Препарат промывают водой, заливают протравой и подогревают стекло до появления паров в течение 2 мин. Протраву сливают и препарат тщательно промывают во­дой. Далее обработку препарата проводят серебрением. Разбав­ленный аммиачный раствор серебра наливают на мазок и стекло несколько раз осторожно подогревают в течение 2 мин до появ­ления паров. Препарат промывают водой, высушивают и микро­скопируют с иммерсионной системой. Бактерии в препарате окра­шены в черный или темно-коричневый цвет, а жгутики, часто спу­танные, — в светло-коричневый или желтый.

Контрольные вопросы

1. Что такое жгутик? Перечислите типы жгутикования;

2. Расскажите о строении жгутика;

3. Объясните процесс сборки жгутика;

4. В чем отличия в организации жгутиков у грамотрицательных и грамположительных прокариот?

5. Раскройте сущность методов выявления жгутиков бактерий.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7.

ВЫЯВЛЕНИЕ КИСЛОТОУСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ

Цель работы: освоить методы определения кислотоустойчивости бактерий.

Оборудование, материалы: световой микроскоп, иммерсионное масло, суточная культура бактерий, фильтровальная бумага, бактериологические петли, спиртовки, предметные стекла, набор красителей (карболовый фуксин Циля, 5% р-р H₂SO₄, метиленовый сини по Леффлеру, азур, эозин, метиленовый синий).

Теоретические сведения

Кислотоустойчивость — свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость обус­ловлена особенностями химического состава клеточной стенки вы­шеупомянутых бактерий: высоким содержанием в ней сложных липидов и, в частности, наличием миколовых кислот.

Практическая часть

Наибольшее распространение получил способ выявления кислотоустойчивости по Циль — Нильсену. На обезжиренном пред­метном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воз­духе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фукси­ном Циля и затем 2—3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением па­ров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тот­час отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ным раствором H₂SO₄. Для этого предметное стекло погружают 2—3 раза в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3—5 мин метиленовым синим по Леффлеру. Краску сливают, препарат промы­вают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. При строгом соблюдении режима окраски кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчи­вые — синий. Кислотоустойчивость можно определить у клеток любого возраста.

Окраска по Романовскому — Гимзе. Краситель Романов­ского — Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением к 10 мл ди­стиллированной воды (рН 7,0—7,2) прибавляют 10 капель имеющегося в продаже красителя Романовского — Гимзы. Приготовленный раствор красителя тотчас наливают на фик­сированный мазок или предметное стекло с окрашиваемым препаратом погружают в стаканчик с красителем. Через час краситель сливают, препарат промывают водой и высушива­ют на воздухе.

Краситель Романовского — Гимзы, имеющий в растворе сине-фиолетовый цвет, окрашивает цитоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядра клеток, так же как и микробные тела, в фиолетово-красный.

Контрольные вопросы

1. Что такое кислотоустойчивость бактерий?

2. Какие микроорганизмы обладают кислотоустойчивостью?

3. Раскройте сущность метода окраски по Цилю-Нильсену;

4. Раскройте сущность метода окраски по Романовскому-Гимзе.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 8

ИЗУЧЕНИЕ КАПСУЛ И СЛИЗИСТЫХ ОБРАЗОВАНИЙ

Цель работы: освоить методы определения кислотоустойчивости бактерии

Оборудование, материалы: световой микроскоп, иммерсионное масло, суточная бульонная или агаровая культура бактерий, бактериологические петли, предметные стекла, спиртовки, набор красителей (жидкая тушь, фуксин, карболовый фуксин Циля, смесь Никифорова, абсолютный метанол).

Теоретические сведения

Снаружи клеточная стенка прокариот часто бывает окружена слизистым веществом. Такие образования в зависимости от струк­турных особенностей получили название капсул, слизистых слоев или чехлов. Все они являются результатом биосинтеза прокарио­тами органических полимеров и отложения их вокруг клеток.

Под капсулой понимают слизистое образование, обвола­кивающее клетку, сохраняющее связь с клеточной стенкой и име­ющее аморфное строение. Если толщина обра­зования меньше 0,2 мкм и, следовательно, оно может быть обна­ружено только с помощью электронного микроскопа, говорят о микрокапсуле. Если больше 0,2 мкм, говорят о макрокапсуле. По­следнюю можно видеть в обычный световой микроскоп.

Наличие капсулы зависит от штамма микроорганизма и усло­вий его культивирования. Бактерии, образующие капсулу, могут легко в результате мутации превращаться в бескапсульные фор­мы, что не приводит к какому-либо нарушению клеточной ак­тивности, поэтому капсулы нельзя рассматривать как обязатель­ный структурный компонент прокариотнои клетки.

В отличие от капсул чехлы имеют тонкую структуру. Нередко в них обнаруживают несколько слоев с разным строением. Чехлы как более сложные структуры имеют обычно и более сложный химический состав. Чехлы ряда бактерий, метаболизм которых связан с окислением восстановленных соединений металлов, часто инкру­стированы их окислами. Между этими структурами у прокариот обнаружено много переходных форм, так что иногда нельзя четко отграничивать капсулу от слизистых клеточных выделений или капсулу от чехла.

Капсулы, слизистые образования и чехлы могут содержать ком­поненты, одинаковые с клеточной стенкой, однако их химиче­ские составы не идентичны. Как правило, химический состав кап­сул, образуемых бактериями, родо- или видоспецифичен. Основ­ные химические компоненты большинства капсул прокариот — полисахариды гомо- или гетерополимерной природы. Для ряда бактерий показана способность синтезировать и выде­лять в окружающую среду волокна целлюлозы.

Хотя капсулы, слизистые вещества и чехлы являются необяза­тельными структурами прокариотной клетки, им приписывают определенные полезные для клетки функции. Вязкость внеклеточной среды, обусловленная наличием слизистых веществ, очевид­но, благоприятна для клетки. Они защищают клетку от механи­ческих повреждений, высыхания, создают дополнительный ос­мотический барьер, служат препятствием для проникновения фагов. Иногда слизистые образования могут служить источником запас­ных питательных веществ. С помощью слизи осуществляется связь между соседними клетками в колонии, а также прикрепление клеток к различным поверхностям. Способность определенных бактерий синтезировать эти своеобразные внеклеточные полиме­ры находит практическое применение: их используют в качестве заменителя плазмы крови, а также для получения синтетических пленок.

От капсулы (диффузного полисахаридного слоя, часто значи­тельной величины) следует отличать гликокаликс — сеть тяжей полисахаридов, помогающих клеткам прикрепиться к твердым субстратам и формировать биопленки на поверхности неподвиж­ных предметов в водных средах или на поверхностях растительных или животных тканей хозяев.