Практическая часть

Микроскопия микроорганизмов в живом состоянии. Для изучения формы и выявления подвижности бактерии изучают в живом состоянии в препаратах раздавленной или висячей капли.

Раздавленная капля. На предметное стекло нано­сят каплю бульонной культуры. При обильном росте микро­бов культуру предварительно разводят стерильным изотони­ческим раствором хлорида натрия. Нанесен­ную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и опускают, постепенно вытесняя воздух, находящийся между предмет­ным и покровным стеклами, чтобы избежать образования в ней пузырьков воздуха. В правильно приготовленном препа­рате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жид­кость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.

Висячая капля (рис. 3). На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими края­ми каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из кото­рой жидкость испаряется очень медленно и поэтому препа­рат долгое время остается пригодным для наблюдения.

Рис. 3. Препарат «висячая капля»

Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (8×) на­ходят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зре­ния. По одну сторону линии (края) видно множество мель­чайших капелек конденсата, осевших на внутренней поверх­ности покровного стекла, по другую сторону линии фон рав­номерно серого цвета — искомая капля.

Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на бо­лее сильную (40×) или иммерсионную систему, слегка рас­ширив диафрагму микроскопа.

Подвижные бактерии проходят с одинаковой скоростью большие пространства, иногда через все поле зрения микро­скопа, вращаясь вокруг своей оси.

Живые микробы, находящиеся в препарате раздавленной капли, можно изучать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопирования толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, покровных — 0,2 мм. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом. Вследствие этого неосвещенное поле зрения оста­ется совершенно темным, а микробные тела, отражающие лу­чи света, освещены очень ярко.

При микроскопировании препаратов в темном поле зре­ния на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю кед­рового или вазелинового масла, поверх которой очень осто­рожно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, накладывают препарат. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата не­обходимо для того, чтобы при микроскопировании с иммер­сионной системой проходящие лучи света не преломлялись.

Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизма­ми была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикла­дывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стек­ло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если ка­саться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Препараты живых клеток рассматривают с «сухими система­ми» микроскопа. Препараты, работа с которыми закончена, преж­де чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе.

Препарат «микрокультура» или «агаровая пленка». На тон­кое, простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0,2—0,3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют по всей поверхности стекла. После застывания среды петлей удаляют лишний агар, оставляя два тонких участка пленки величиной с покровное стекло каждый. В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма. Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Перед микроскопированием на пленку с выросшей микрокульту­рой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыха­ния пленки и затем осторожно накрывают покровным стеклом. Метод, основанный на получении роста микроорганизма непо­средственно на предметном стекле, позволяет вести микроскопи­ческое наблюдение за процессами роста и развития, влиянием токсических и других агентов на эти процессы. На препаратах не нарушается естественное расположение клеток в растущей колонии.

Приготовление фиксированных препаратов. Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Исследуемый материал распределя­ют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обез­жиренного стекла. Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды. Маленькую каплю исследуемой жидкости на­носят бактериальной петлей на предметное стекло и круго­выми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

2. Приготовление мазка из культур с плот­ных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидко­сти стала слегка мутноватой. После этого излишек микроб­ного материала на петле сжигают в пламени горелки и при­ступают к приготовлению мазка по описанному выше спо­собу (1).

Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окраши­ваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которо­го положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие примене­ние химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации. Предметное стек­ло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением прово­дят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надеж­ность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикла­дывают к тыльной поверхности левой кисти. При правиль­ном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения (табл. 2). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

Таблица 2. Вещества для химической фиксации

Фиксирующее вещество	Время фиксации, мин
Безводный метиловый спирт Этиловый (винный) спирт 96% Жидкость Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1) Жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, уксусной кислоты ледяной 10 мл)	5 10-15 10-15 10-15

Контрольные вопросы

1. Перечислите методы исследования живых бактерий;

2. Что можно выяснить о бактериях по препарату «висячая капля»?

3. Для каких микроорганизмов используют препарат-«отпечаток»?

4. Что такое микрокультура?

5. В чем заключается суть фиксации препаратов? Приведите примеры физической и химической фиксации.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

Определение размеров микроорганизмов

Цель работы: Изучить разнообразие микроорганизмов по размерным характеристикам, освоить методы и приспособления по определению размеров микроорганизмов, научиться вычислять цену деления.

Оборудование, материалы: Световой микроскоп, фазово-контрастный микроскоп, окулярная линейка-микрометр, объективный микрометр, суточная бульонная культура бактерий, предметные стекла, покровные стекла.

Теоретические сведения

Несмотря на то, что термин «микроорганизм» подразумевает малые размеры, этот признак варьирует в довольно широких пре­делах (табл. 3).

Таблица 3. Размеры отдельных представителей живого мира

Организм	Размер, мкм
Нанобактерии	d < 0,05
Поксвирусы	d ≈ 0,3
Микоплазмы	d = 0,3
Nanochloron eukaryorum	d ≈ 1,0 – 2,0
E.coli	1,1 – 1.5 × 2,0 – 6,0
Спирохеты	1,5 × 50,0
Oscillatoria sp.	d ≈ 7,0
Эритроциты	d = 7,0
Epulopiscium fishelsoni	100,0 × 600,0
Thiomargarita namibiensis	d ≈ 600,0

Размеры клеток большинства прокариот находится в пределах 0,2— 10,0 мкм (Рис. 4). Однако среди них есть «карлики» (трепонемы, микоплазмы и нанобактерии размерами примерно 0,05 — 0,1 мкм) и «гиганты» (Achromatium, sp. длиной до 100 мкм).

Рис. 4. Шкала относительных размеров микроорганизмов

Самыми крупными из выделенных до настоящего времени прока­риот являются клетки Epulopischtm fishetsoni, обитающие в кишечнике глубоководной рыбы-хирурга, длиной до 600 мкм и диаметром до 100 мкм, и Thiomargarita namibiensis, найденные в прибрежных водах Чили и Намибии, диаметром 400 — 600 мкм. В то же время необходимо отметить, что морская водоросль Nanochloron еиkаrуоrum, несмотря на очень малые размеры (см. табл. 3), имеет настоящее ядро, хлоропласты и митохондрии. Резюмируя данные табл. 3, можно сделать вывод о том, что размеры извест­ных в настоящее время прокариотических микроорганизмов на­ходятся в пределах от 0,05 до 600 мкм.