Практическая часть

Тонкую структуру клеточной стенки хорошо видно лишь в электронном микроскопе. Для наблюдения клеточ­ной стенки в световом микроскопе применяют метод темного поля либо специальную окраску, с помощью которой удается легко вы­явить границы между отдельными клетками, расположенными в виде длинных нитей или плотных агрегатов. На обезжиренном стекле делают мазок клеток исследуемых бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 5 мин 5%-ным раствором фосфоромолибденовой кислоты. Затем препарат промывают водой и окрашивают не более 15 сек 0,02%-ным раствором кристаллвиолета. Снова промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клеточная стенка окрашивается в чер­ный, а цитоплазма — в бледно-сиреневый цвет.

Можно использовать метод окраски клеточной стенки по Гутштейну. Мазок выдерживают 15 мин в жидкости Карнуа, про­травляют в течение 25 мин 10%-ным водным раствором таннина промывают водой и окрашивают водным фуксином или 0,02%-ньш раствором кристаллического фиолетового в течение 30—60 с. За­тем препарат промывают, высушивают и микроскопируют с им­мерсией.

Окраска по Граму. С молекулярной организацией и хи­мическим составом клеточной стенки связывают способность бак­терий окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным ди­агностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями, триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерий удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом, при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фио­летовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей об­работке фуксином или сафранином они приобретают розовую ок­раску. Как правило, по Граму окрашивают клетки молодых, чаще всего суточных, культур, так как способность удерживать краси­тель зависит от физиологического состояния бактерий. Например, некоторые бактерии после прекращения активного роста теряют способность окрашиваться по Граму.

Окраска по Граму заключается в следующем. На одном обез­жиренном стекле делают мазки разных микроорганизмов: в цен­тре— мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа — кон­трольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть грамположительными (например, Micrococcus luteus или Bacillus cereus), другой — грамотрицательными (например, Escherichia coli). Мазки следует готовить тонкими, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образо­вывали скоплений. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1—2 мин карбо­ловым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Затем краситель сливают и, не промывая мазок водой, обрабатывают его 1—2 мин раствором Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 0,5—1,0 мин 96%-ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1—2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промы­вают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной сис­темой. При правильном окрашивании грамположительные бакте­рии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные — розово-крас­ный цвет.