2.3. Инактивированные вакцины

Штаммы, предназначенные для изготовления инактиви- рованных вакцин, представляют собой культуру типичного представителя данного вида вируса, по биологическим свой­ ствам они идентичны циркулирующим в природе эпизоотиче­ ским штаммам. ' ', .'.

Изготовление инактивиров'анны'х вакцин также ' начина-

ется с культивирования и накопления производственного штамма вируса в чувствительной биологической системе (жи­вотные, .эмбрионы птиц, культура клеток). Затем вирусо-содержащий материал гомогенизируют, центрифугируют, фрагменты клеточных структур, как правило, удаляют. Из обработанного материала вирус концентрируют ультрацен­трифугированием, сорбцией на геле гидрата окиси алюми­ния или осаждением при помощи химических веществ, после чего вирус инактивируют.

Выбор инактиватора проводят с таким расчетом, чтобы повредить геном (нуклеиновую кислоту), не повреждая ан­ тигенов, входящих в состав капсида. и суперкапыгдной обо­ лочки. . *■

Для инактивации вирусов используют физические факто­ры (температура до 60°, ионизирующие излучения, действие дневного.света в присутствии красящих веществ, ультрафио­летовые лучи, ультразвук) или химические факторы (измене­ние рН, формалин, бетапропиолактон, гидроксиламин, димер-этиленимин, азотистая кислота, аскорбиновая кислота, глю-таральдегид, этанол, кристаллвиолет и др.). Наиболее часто применяют формалин, бетапропиолактон, димерэтиленимин.

Для повышения иммуногенной активности в состав ин-активированной вакцины вводят стимуляторы иммуногене­за — адъюванты (гидроокись алюминия, аэросил, сапонин, минеральные масла и реже другие препараты).

На заключительном этапе с целью ликвидации возможной контаминации в вакцину вводят консервант (фенол, глицерин, мертиолат,. антибиотики), после чего фасуют и подвергают контролю. : ■ ■ ..

Для примера приведем основные данные по изготовлению противоящурной концентрированной гидроокисьалюминие-вой (ГОД) формолвакцины по методу Френкеля.

Вакцину готовят путем размножения иммуногенных эпи­зоотических штаммов вируса ящура с установленной типовой и вариантной принадлежностью в переживающих эпителиаль­ных тканях языка кр. р. скота.

На мясокомбинатах от только что убитых клинически здо­ ровых животных берут языки, их тщательно промывают, де­ зинфицируют этиловым спиртом и ультрафиолетовыми лу­ чами, затем на специальных приспособлениях с них снимают эпителий, в виде, стружки. С одного языка получают до 20,0 г ткани. . . . - .

Эпителиальную ткань помещают в 5-литровые бутыли,

заливают и отмывают солевым раствором Тироде, в свеже-добавленном растворе (на 1 кг ткани 4 л раствора) ткань доставляется на биофабрику (срок хранения эпителия не более 40 час. с момента убоя животных).

На биофабрике эпителиальную ткань помещают в специ­альные реакторы (ферментеры) емкостью 200—600 л. В ре­актор вводят питательную среду Френкеля, содержащую 14 аминокислот, витамины, гормоны, соли, пептон и антибио­тики, после чего туда же вносят вируссодержащую суспен­зию с известным инфекционным титром и активностью в РСК (на 1 кг эпителия вносят 6 л среды и 250 мл вируссодержа­щеи суспензии).

Культивирование ведут при умеренном автоматическом перемешивании и непрерывной аэрации в течение 14—16 часов, после чего вируссодержащую культуральную жидкосты перекачивают в другую емкость, а в реактор вводят новую порцию среды и снова культивируют 8—10 часов, после чего культуральную жидкость берут для изготовления вакцины, а эпителиальную ткань утилизируют.

■Культуральную жидкость центрифугируют, сепарируют и вирус двукратно концентрируют сорбцией на гидроокиси"

алюминия.

Составление серии вакцины производят в реакторе, куда * на 60 частей вируссодержащеи суспензии вводят 32 части 6% гидроокиси алюминия, 1 часть гликоколового"буфера, 1 часть 5%. раствора формалина, смесь инактивируют, 36—38 час. при 25°С, после чего добавляют б частей 10% раетвора хинозоля, 0,3—0,5% сапонина (в зависимости от его адъювантных свойств), антивспениватель и антибиотики. Содержимое пере­мешивают и расфасовывают.

В случае изготовления трехвалентной противоящурной" вакцины А-О-С берут три моновалентных вакцины, смеши­вают в равных объемах, расфасовывают.

Вакцина проходит контроли, после чего флаконы этике-тируют и вакцину выпускают для применения.

2.4. КОНТРОЛЬ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН

Контроль вакцин осуществляют государственные кон­тролеры ВГНКИ ветеринарных препаратов (г. Москва),

При большом разнообразии типов противовирусных вак­цин неодинаковы и методы оценки их качества,■однако, тре­бования к основным показателям максимально унифициро­ваны.

14

Основными показателями хорошего качества вакцин яв­ляются: стерильность (для инактивированных), чистота, т. е. отсутствие контаминирующих агентов (для живых), безвред­ность, допустимая степень реактотенности, иммуногенность, эпизоотическая и эпидемиологическая безопасность (для жи­вых вакцин против болезней, свойственных человеку и жи­вотным).

Для контроля на чистоту живых и стерильность инактиви­рованных вакцин из отобранных флаконов производят посе­вы на питательные среды (МПА, МПБ с глюкозой, бульон и агар Мартена, МППБ под вазелиновым маслом, бульон и агар Сабуро или Чапека), выдерживают их при 36—37° до 15 дней. При отсутствии роста через 5—6 дней делают пере­севы на аналогичные среды, их выдерживают до 10 дней. Роста микробов, не должно быть.

При наличии роста получают чистые культуры, проводят определение вида с обязательным изучением патогенных и токсигенных свойств. При выделении патогенных микро­организмов вакцину бракуют.

Контроль на полноту инактивации вируса осуществляют путем проведения трех слепых пассажей на чувствительной биологической системе, при этом репродукции вируса быть не должно.

Безвредность вакцин определяют на основании данных о выживании, отсутствию клинических признаков переболева-ния и гибели привитых вакциной животных, при этом лабо­раторным животным вводят максимально переносимые дозы, а сельскохозяйственным — в 2—10 раз превышающие реко­мендуемые для практического применения. Привитые живот­ные должны оставаться здоровыми при наблюдении за ними не менее 10 дней.

Реактогенность вакцин определяют по наличию у приви­тых животных температуры,' местной воспалительной реак­ции, вовлечению в процесс регионарных лимфоузлов, реже с помощью лабораторных анализов крови и мочи.

Для выявления неспецифической токсичности, обуслов­ленной наличием в вакцинах стабилизаторов, сорбентов и консервантов, используют химические методы исследования, например, на содержание свободного формальдегида.

Кроме того, вакцины не должны вызывать аллергизации организма и образования опухолей.

Контроль на иммуногенность проводят на восприимчивых лабораторных или сельскохозяйственных животных путем

15

заражения вакцинированных животных вирулентным штам­мом в дозе от 5 до 200 полулегальных (ЛДбо) или инфици­рующих (ИДйо) доз при одновременном заражении равного количества равноценных невакцинированных животных. Ме­жду вакцинацией и заражением должен быть срок, достаточ­ный для формирования иммунитета, — он зависит от вакци­ны — от двух суток до двух недель.

Вакцину считают иммуногенной при отсутствий клиниче­ских признаков и гибели не менее чем у 80% вакцинирован­ных при заболевании или гибели не менее 80% контрольных животяых. Допускается заболевание 30%' вакцинированных при 100%-ной гибели контрольных животных.

Реже об иммуногенности вакцины судят по титрам спе­цифических антител в сыворотке крови привитых животных, выявляемым с помощью серологических реакций.

Эпизоотическую безопасность вакцин выявляют на есте­ственно восприимчивых животных, вакцинированных jipo-тив данной инфекции в условиях одного или нескольких хозяйств, благополучных по заразным болезням, а эпизоо­тическую эффективность в условиях хозяйств, неблагополуч­ных по той инфекции, против которой предназначена вакцина.

Для примера приведем контроль противоящурной концен-.трированной ГОА формолвакцины. Ее проверяют на безвред­ность, авирулентность, стерильность и иммуногенность (ак­тивность) ■ :

2.4.1. Контроль на безвредность на лабораторных живот­ ных.

Вакцину вводят подкожно 5 морским свинкам (массой 400—600 г) в дозе 2 мл, 5 белым мышам (массой 25 г) в дозе 0,3 мл и 2 кроликам (массой 1,5—2 кг) в дозе 3 мл. Срок на­блюдения 10 суток. Животные должны остаться живыми, до­пускается появление на месте введения вакцины некротиче­ской язвы (результат действия сапонина).

В случае заболевания или гибели лабораторных живот­ных проводят бактериологические исследования. При обна­ружении патогенной микрофлоры вакцину бракуют.

2.4.2. Контроль на авирулентность, безвредность и ток­ сичность на крупном рогатом скоте.

Крупный рогатый скот в возрасте не моложе 18 месяцев и массой не менее 250—300 кг, не ниже средней упитанности поставляют из благополучных хозяйств, где в течение 2 лег не было заболевания животных ящуром и скот не прививали против ящура. В период карантина (14 дней) с помощью

¹ 16

реакции серозащиты или реакции нейтрализации убеждаются в отсутствии у них специфических вируснейтр ализующих антител.

2.4.2.1. Контроль на авирулентность проводят на 3 живот­ ных, которым под слизистую оболочку языка после анестезии 5% раствором новокаина вводят 2,5 мл вакцины в 10 точек. За животными наблюдают 10 дней, ежедневно измеряют тем­ пературу тела.

Животные должны остаться здоровыми.

При появлении афт'на языке, слизистой оболочке ротовой полости или на конечностях вакцину считают вирулентной,, выясняют причины и принимают меры по инактивации ви­руса или вакцину бракуют.

2.4.2.2. Контроль на безвредность и токсичность проводят на тех же 3 животных при отсутствии у них афт. Им допол­ нительно вводят подкожно в области средней трети шеи вак­ цину в тройной дозе. На месте введения вакцины появляется инфильтрат размером 5—15 см, который затем рассасывает­ ся. Температура тела у животных через 12—24 часа может повыситься до 40—41° и удерживаться 1—3 дня. Эти изме­ нения расцениваются как местная и общая реакция на сапо­ нин.

Через 10 дней после введения вакцины животных убива­ют, проводят осмотр головы, конечностей и рубца. Вакцину считают авирулентной и безвредной при отсутствии измене­ний, характерных для ящура.

Если серия вакцины окажется вирулентной, она подлежит выбраковке. Если вакцина авирулентна и безвредна, ее раз­ливают и отбирают флаконы в начале, середине и конце фасовки для контроля на стерильность и иммуногенность.

2.4.3. Контроль на стерильность.

Из отобранных флаконов делают высевы на МПБ, МПА и МППБ под вазелиновым маслом.

При отсутствии роста в первичных посевах через 10 дней производят пересев на те же питательные среды. Наблю­дение ведут еще 5 дней. При отсутствии роста данную серию вакцины считают стерильной.

При наличии роста проводят микроскопию, ориентиро­вочно определяют характер микрофлоры и производят пере­сев на дифференциальные питательные среды. Выделенную культуру исследуют на вирулентность и токсичность на 2 кроликах, 2 морских свинках и 5 белых мышах.

При выделении патогенной для лабораторных животных

2 17

микрофлоры вакцину бракуют (наличие сапрофитной микро­флоры допускается, но в вакцину вводят антибактериальные препараты).

2;4;4. Контроль на иммуногенность.

С 1968 г. проводят контроль иммуногенности вакцины на лабораторных животных, для чего морских свинок и белых мышей прививают вакциной в цельном виде и в разведениях (на каждую дозу берут по 8 свинок и 20 мышей), а через 11 дней после вакцинации привитых и контрольных живот­ных заражают адаптированным к ним вирусом ящура.

Учет результатов проводят через 3, 5 и 7 суток по нали­чию генерализованного ящурного процесса, на основании чего рассчитывают 50%-ную вакцинирующую дозу. Вакцину счи­тают иммуногенной, если 50%-ная вакцинирующая доза на морских свинках не превышает 0,35 мл, на белых мышах — 0,47 мл.

Если 50%-ная вакцинирующая доза вакцины будет выше указанной, иммуногенность данной серии проверяют на круп­ном рогатом скоте, для чего смесью вакцины из 20 флаконов прививают 6 животных подкожно в дозе 5 мл в области средней трети шеи.

У привитых животных через 12—24 час. может повыситься температура тела до 40,5° и удерживаться 1—2 суток. На Месте введения может образоваться отек размером до 10 см, который рассасывается к 10-му дню. Эти изменения расце^ ниваются, как реакция на сапонин. .

На 15—17 день вакцинированных животных заражают путем введения им автозного вируса ящура, гомологичного вакцинному, в 2 точки' 'слизистой оболочки языка по 1000О ИДао в объеме 0,2 мл. Одновременно для „контроля зара­жают двух невакцинироваиных¹ животных.

Наблюдение за животными ведут в течение 10.дней, еже­дневно измеряя температуру. Через 10 дней их убивают, проводят патологоанатом и чески й осмотр головы, конечностей и рубца.

Вакцину считают активной, если она предохраняет от генерализованного ящурного процесса всех животных: у при­витых не должно быть афт на губах, нёбе, деснах, слизистой рубца и вторичных афт на конечностях, допускается только появление афт на месте введения вируса.

Контрольные животные должны заболеть генерализован­ной формой ящура не позднее 96 час. после заражения.

Флаконы с вакциной, прошедшей контроли, перед отправ-

кой на склад обрабатывают вместе с тарой 2%-ным раство­ром едкого натра, в каждый ящик вкладывают наставление по ее применению.

Транспортируют и хранят вакцину при температуре 1—8°.

При нарушении условий хранения, транспортировки, за­мораживании, нарушении целостности флаконов, отсутствии этикеток вакцина к применению не подлежит.