Експериментальна частина розділ 3 матеріали та методи досліджень

3.1. Матеріали

У роботі було використано такі реагенти і матеріали: гептан, ізопропіловий спирт, 96% етиловий спирт (фірма "Альфарус"), 20% трихлороцтову кислоту, KCl, 0,8% тіобарбітурову кислоту, розчин пероксиду водню, молібдат амонію, Na₂CO_3, NaOH, CuSO₄5Н₂O, Na₃C₆H₅O₇2Н₂O (фірма "Макрохім"), цефтріаксон (фірма БХФЗ, Україна). Акриламід 30 %-й розчин, біс-акриламід 0,8 %-й розчин, гліцин, гліцерол 30 %-й розчин; бромфеноловий синій 0,0025 %-й розчин; ТЕМЕD, 10 %-й розчин персульфату амонію,. розчин тетразолію нітро-синього, рибофлавін (фірма "Альфарус").

Для приготування водних розчинів та середовища інкубації застосовували дистильовану воду.

Реактиви та органічні розчинники кваліфікації х.ч. або о.х.ч. .

3.2. Лабораторні тварини

У дослідах використовували білих нелінійних щурів самців з початковою масою 216 г. Щурів утримували на стандартному раціоні віварію.

3.3. Схема проведення експерименту

Перед початком експерименту щури були поділені на 4 групи по 5 тварин в кожній: І гр. - контроль 5 діб, ІІ гр. - контроль 14 діб, ІІІ гр. цефтріаксон 5 діб, IV - цефтріаксон 14 діб. Цефтріаксон вводили внутрішньом'язево одноразово в дозі 50 мг/кг. Щурам ІІІ гр. цефтріаксон вводили з 1-го по 5-й день, аутопсія на 6-й день. Відповідно контрольна група (І) отримувала 0,2 мл дист. води внутрішньом'язево з 1-ого по 5-й день, аутопсія на 6-й день. Щурам IV групи вводили цефтріаксон з 1-ого по 14-й день включно, аутопсія на 15-й день. Відповідно контрольна група отримувала ін'єкцію води. В кінці експерименту щурів умертвляли інгаляцією CO2 з наступною цервікальною дислокацією.

3.4. Моніторинг клінічних параметрів стану щурів

Моніторинг клінічних параметрів стану щурів, які визначались за масою тіла, млявістю (0 - 3 бали: 0 - норма, 1 - помірно піднята шерсть, 2 - тварина брудна, зменшення спонтанних рухів, 3 - тварина майже не рухається, не реагує на інших тварин), діареєю (0 - 3 бали: 0 - норма, 1 - м'які чи водянисті випорожнення, волога пляма навколо ануса до 1 см² , охоплює нижню частину живота, 3 - пляма до грудної клітки), оцінювали щоденно.

3.5. Отримання гомогенату слизової оболонки

Після декапітації видаляли товсту кишку, розрізали в повздовжньому напрямку, вивертали слизовою назовні та ретельно промивали. Далі обережно відділяли слизовий шар товстої кишки та гомогенізували у 0,9 %-у розчині NaCl при Т = +4ºС з використанням DOUNCЕ гомогенізатора (Sigma-Aldrich).

Отриманий гомогенат слизової оболонки товстої кишки фільтрували крізь чотири шари нейлонової сітки та використовували для проведення експериментальних досліджень

3.6. Визначення концентрації протеїнів методом Лоурі

Метод базується на утворенні забарвлених продуктів ароматичних амінокислот з реактивом Фоліну у поєднанні з біуретовою реакцією на пептидні зв’язки. В дослідну пробірку наливали 400 мкл проби та 2 мл реактиву С: 10 мл реактиву А (2 г Na₂CO₃ + 400 мг NaOH на 100 мл dist H₂O) + 200 мкл реактиву В (500 мг CuSO₄5Н₂O + 1 г Na₃C₆H₅O₇2Н₂O на 100 мл).

В контрольну пробу замість досліджуваного білкового матеріалу додавали 400 мкл dist H₂O. Через 10 хвилин в пробірки додавали 200 мкл реактиву Фоліна і залишали ще на 30 хвилин для розвитку забарвлення, його інтенсивність вимірювали на спектрофотометрі при =750 нм. Кількість мікрограм білку визначали за допомогою калібрувального графіку.