Торможение метода.
В лунки полистироловых планшет вносят антиген в рабочей дозе, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают трижды растворителем.
В лунки с антигеном вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки, разведения которой предварительно приготовлены в пробирках (как описано выше). Планшеты выдерживают 40 мин при 37о С, отмывают растворителем. Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл иммунного глобулина, меченого J 125, специфичного к сорбированному антигену. Планшет выдерживают 40 мин при 37о С, отмывают трижды растворителем. Определяют остаточную дозу метки в лунках, по сравнению с конъюгатом.
Если в исследуемой сыворотке были антитела, то они блокировали антиген в лунках и последующее внесение меченого иммунного глобулина не приводит к связыванию его с антигеном. Это проявляется отсутствием метки в лунках, где были антитела исследуемой сыворотки. Если антител нет, то внесение меченых антител приведет к связыванию их антигеном, что проявится появлением метки во всех лунках. Это отрицательный результат.
ИфА - иммуноферментный анализ
Основан на конъюгации метки в виде фермента.
Прямой метод.
Метод заключается в непосредственном взаимодействии антигена и антител, когда один из них сорбирован на твердой фазе, а другой мечен ферментом.
В настоящем разделе будет дан новый вариант ИФА, тогда как известные варианты широко описаны в литературе.
ИФАП - иммуноферментный анализ прямой.
В лунки полистироловых планшет, например, Санкт-Петербургского зав. биополимеров или другого производства, вносят растворимый на антиген материал по 0,1 мл в дозе 0,05 мкг на 1 мл и планшет оставляют на 24 ч при комнатной температуре. Планшет отмывают растворителем (0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 0,2 % твина-20, рН 7,2) от несвязавшегося материала.
Предварительно готовят конъюгат: к раствору глобулина иммунной сыворотки, которая должна быть гомологичной предполагаемому антигену по специфичности, в дозе 5 мг на мл, добавляют равный объем раствора каталазы в дозе 10 мг на мл и 0,1 % от объема смеси 2,5 % глутарового альдегида. Смесь выдерживают 30 мин при 37о С, осаждают глобулин 40 % раствором сульфата аммония, растворяют малым объемом растворителя и освобождаются от солей аммония, пропуская глобулин через колонку с сефадексом G-50. Готовый конъюгат хранят с 0,05 % азида натрия или лиофилизируют.
Во все лунки с материалом вносят конъюгат по 0,1 мл и смесь оставляют на 60 мин, после чего трижды промывают растворителем.
Для проявления взаимодействия антигена с антителом необходимо выявить в лунках каталазу. Для этого, вносят субстрат - перекись водорода (0,015 % по 0,1 мл) и через 15 мин вносят хромоген, для проявления реакции каталазы с субстратом - 1 % раствор перманганата калия. Результат реакции оценивают по появлению окрашивания. Если в исследуемом материале есть антиген, то с ним взаимодействуют антитела, которые мечены ферментом. Добавленная перекись водорода разрушается каталазой на воду и атомарный кислород и вносимый хромоген проявляет эту реакцию - жидкость остается красного цвета. Если антигена не было, то антител также не будет как и каталазы. Перекись водорода остается неразрушенной и добавленный перманганат калия моментально меняет цвет на желтый, сходный с контрольной лункой.