2 Этап. Титрование комплемента.
Готовят ряд пробирок: в первую из них вносят 0,05 мл комплемента в разведении 1:10, во вторую - 0,1 мл комплемента, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,2 мл, в пятую - 0,25 мл, в шестую - 0,3 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,4 мл, в девятую- 0,45 мл, в десятую - 0,5 мл. Одиннадцатая пробирка контрольная, которая содержит 0,5 мл растворителя.( таблица № 22).
Во все пробирки доливают растворитель до общего объема 0,5 мл, а затем вносят во все пробирки по 1 мл индикаторной системы и оставляют на 30 мин при 37 о С. После этого, все пробирки просматривают и выбирают наибольшее разведение комплемента, вызывающее гемолиз - это титр комплемента.
Таблица № 22.
Схема титрования комплемента (количество пробирок сокращено)
Ингредиенты |
Номера пробирок и количество ингредиентов, мл |
||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
||
Комплемент 1:10 |
0,05 |
0,06 |
0,07 |
0,08 |
0,09 |
0,1 |
0,14 |
|
|
Растворитель |
0,45 |
0,48 |
0,49 |
0,4 |
0,48 |
0,5 |
0,42 |
0,5 |
|
Разведения |
1:100 |
1:90 |
1:80 |
1:70 |
1:60 |
1:50 |
1:40 |
|
|
Гемсистема |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре |
|||||||||
Результат |
гемолиз |
гемолиз |
гемолиз |
гемолиз |
осадок |
осадок |
осадок |
осадок |
|
Рабочая доза комплемента |
Титр комплемента составляет 1:70, значит рабочая доза комплемента: (1:70х30):100= 1:21 |
В реакцию берут разведение комплемента на 30 % выше, чем его титр, это рабочая доза комплемента.
3 этап. Приготовление индикаторной системы. К 3 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем разведении. Смесь выдерживают 30 мин при 37о С и осадок эритроцитов трижды отмывают растворителем при осаждении или центрифугировании при 500 об\мин в течение 10 мин. Осадок эритроцитов ресуспендируют до 3 % взвеси.
Постановка РСК. Титруют исследуемую сыворотку крови в пробирках от 1:50 до 1:12800 и делают контроли: на сыворотки (исследуемую, положительную и отрицательную), антиген, комплемент. Во все разведения сыворотки, кроме контроля сыворотки, вносят по 0,5 мл антигена. В контроль сыворотки, комплемента и антигена вносят по 0,5 мл растворителя. (таблица № 23).
Смесь встряхивают и во все пробирки добавляют по 0,05 мл комплемента в рабочей дозе. Смесь оставляют на 60 мин при 37о С
После экспозиции в каждую пробирку вносят по 1,0 мл индикаторной системы. Смесь встряхивают и выдерживают 60 мин при 37о С.
. При наличии в сыворотке гомологичных антител, комплемент расходуется на комплекс антиген-антитело первой системы. Это проявляется отсутствием лизиса индикаторных эритроцитов. При отсутствии антител в сыворотке комплемент не расходуется и тогда взаимодействует со второй системой (индикаторной). При этом эритроциты лизируются в первых пробирках.
Реакция связывания комплемента позволяет определять антитела, микробы, вирусы, растворимые антигены, однако он трудоемок и вытеснен при некоторых инфекциях другими методами.
Таблица № 23.
Схема постановки РСК
Дополнительные сведения
Ингредиенты |
Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл |
|||||||||||||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|||||||||||||
Разведения исследуемой сыворотки
|
Контроли |
|||||||||||||||||||
сыворот- ка (+) |
сыворот- ка (_ ) |
компле- мент |
исслед. сывор. |
антиген |
||||||||||||||||
Растворитель |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
|
0,5 |
0,5 |
0,5 |
||||||||||||
Исслед. сыворотка 1:50 |
0,5 |
- |
- |
|
|
|
0,5 |
|
||||||||||||
Разведения |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
|
|
|
1:100 |
|
||||||||||||
Антиген |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
- |
0,5 |
||||||||||||
Комплемент |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
||||||||||||
Заведомо отриц. сыв. |
|
|
|
|
0,5 |
|
|
|
||||||||||||
Заведомо полож. сыв. |
|
|
|
0,5 |
|
|
|
|
||||||||||||
Экспозиция 60 мин при 37о с |
||||||||||||||||||||
Гемсистема |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
||||||||||||
Экспозиция 60 мин при 37о С |
||||||||||||||||||||
Результат РСК |
осадок |
осадок |
осадок |
осадок |
гемолиз |
гемолиз |
гемолиз |
гемолиз |
||||||||||||
Результат анализа |
Исследуемая сыворотка содержит антитела, на что указывает осадок в первых пробирках с сывороткой и положительным контролем, при отрицательной реакции (гемолиз) в других контролях |
Феномен иммунофлюоресценции
Объединяет большую группу методов и реакций, основанных на использовании свечения в люминисцентном микроскопе антител, меченых флюорохромом.
Непрямой метод.
РИФП - реакция иммобилизация прямая.
Для проведения реакции необходимо иметь:
1. Предметные стекла.
2. Иммунные сыворотки, меченые флюорохромом.
3. Антиглобулиновые сыворотки, меченые флюорохромом.
4. Исследуемый материал (микробы, культуры и пр.).
5. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия.
На обезжиренное предметное стекло делают мазки исследуемого материала или мазки-отпечатки. Препараты подсушивают, фиксируют смесью Никифорова. На мазок наносят иммунную сыворотку, специфичную в отношении предполагаемого в материале микроба, меченую флюорохромом. Препарат ставят во влажную камеру на 30 мин при 37о С, а затем промывают в растворителе и ополаскивают в дистиллированной воде 10 мин, сушат при 18-20О С и исследуют в люминисцентном микроскопе с иммерсионной системой.
Если микробы в мазке есть, то вокруг них будут скопления зеленого специфического свечения, а фон может равномерно слабо светиться. Это меченые антитела окружили гомологичную клетку. Оценку интенсивности специфического свечения ведут по 4-кресной системе: ++++ или +++ яркая флюоресценция, ++ и + слабая флюоресценция клеток.