книги из ГПНТБ / Рачинский, В. В. Курс основ атомной техники в сельском хозяйстве учебное пособие

если изучают распределение меченого элемента по органам ра­ стения, то после введения меченого элемента в растение его высушивают под прессом, помещают на рентгеновскую пленку и получают отпечаток, характеризующий пространственное рас­ пределение меченого элемента в различных органах и тканях растения.

Существенную часть практической авторадиографии состав­ ляет определение времени экспозиции. Оно зависит от активно­ сти исследуемого объекта и чувствительности фотоэмульсии. Установлено, что попадание Ю6— 107 р-частиц на 1 см2 поверх­ ности фотографической пленки создает удовлетворительное авторадиографическое изображение.

Введем следующие обозначения: А0— число частиц, испу­ скаемых радиоактивным объектом в направлении фотоэмульсии с единицы площади радиоактивного объекта за единицу време­ ни (определяется измерением поверхностной активности объекта счетчиком частиц); N i-— чувствительность фотоэмульсии — число падающих на единицу поверхности фотослоя частиц, создающих заданное почернение; t — время экспозиции; Гцг — период полу­ распада радиоактивного изотопа.

Формулу для расчета экспозиции можно вывести из урав­ нения

(8. 1)

смысл которого состоит в том, что чувствительность фотоэмуль­ сии численно приравнивается числу частиц, получаемых с еди­ ницы площади радиоактивного объекта в направлении фото­ эмульсии за время экспозиции. Из уравнения (8.1) находим

(8.2)

Уравнение (8.1) составлено при допущении, что все части­ цы, рассеянные в направлении фотоэмульсии, участвуют в со­ здании авторадиографического изображения (100%-ная эффек­ тивность). Однако это условие не всегда соблюдается. Поэтому в формулу (8.2) вводят коэффициент, учитывающий эффектив­ ность фотоэмульсии по отношению к регистрации данного излу­ чения. Если обозначить буквой k долю падающего на фотослой потока частиц, создающих авторадиографическое изображение, то время экспозиции можно рассчитать по формуле:

240

тельно меньше единицы. Фактор эффективности k зависит от типа фотоэмульсии, энергии излучения и других условий, при которых получают авторадиографическое изображение.

Необходимо отметить, что на практике, как правило, осуще­ ствляют лишь ориентировочную предварительную оценку экс­ позиции. Поэтому на дальнейшем уточнении формулы (8.3) не останавливаемся.

Хотя идея авторадиографического метода проста, техника получения авторадиографов, отражающих реальное распреде­ ление меченых элементов, сопряжена с рядом трудностей. Дело в том, что при подготовке биологического объекта к экспониро­ ванию необходимо проявить работу о том, чтобы в процессе подготовки не допустить искажения исходного, реального рас­ пределения меченого элемента. Способ экспонирования биоло­ гического объекта на рентгеновской пленке должен гарантиро­ вать отсутствие химического воздействия на нее веществ, содер­ жащихся в биологическом -объекте. В противном случае можно получить искаженное авторадиографическое изображение. Авто­ радиограф растения уже был показан на рис. 2.8. Авторадио­ графы можно получать как для макроскопических биологических объектов, так и для микроскопических объектов — клеток мик­ роорганизмов, срезов тканей. Получение таких авторадиографов называется микроавторадиографией.

Для микроавторадиографии используют особые мелкозер­

Скорость перемещения меченых элементов в растениях мож­ но определять двумя методами. Первый из них имеет сходство

тографии (методика «меченой волны», см. § 3 гл. 3). Для опре­ деления скорости перемещения меченого элемента в двух задан­ ных точках растения (например, в двух точках на стебле или листе растения) устанавливают коллимированные счетчики-щупы (рис. 8.1). Меченый элемент вводят в растение через корневую систему. Растительные ткани, по которым распространяется ме­ ченый элемент, можно рассматривать как гетерогенную прово­ дящую систему. Вдоль стебля распространяется размытый фронт меченого элемента. В определенный момент времени меченый элемент дойдет до первой точки, и счетчик-щуп зарегистрирует

241

Время появления активности в заданной точке зависит от удельной активности меченого элемента и чувствительности де­ тектора. Чем больше удельная активность меченого элемента и чем чувствительней радиометр, тем точнее регистрируется самая передняя точка фронта меченого элемента. Разность вре­ мени появления активности в заданных точках равна времени

Рис. 8.1. Фронтальная методика определения мак­ симальной скорости перемещения меченого эле­

мента по стеблю растения:

1 и 2 —счетчики-щупы:

время перемещения t, можно рассчитать скорость перемещения меченого элемента: v=L/t.

Скорость перемещения самой передней точки фронта мече­ ного элемента определяет максимальную скорость перемещения фронта элемента. Но так как радиометрическая установка имеет определенную чувствительность, она не может зарегистрировать

.242

самую переднюю точку размытого фронта меченого элемента.

Рис. 8.2. Определение сред­ ней скорости перемещения меченого элемента по стеб­ лю растения с помощью методики меченой волны:

нии потоков переноса веществ в определенном направлении бу­ дет распространяться «волна» меченого элемента. Если на неко­ тором расстоянии от места инъекции поставить счетчик-щуп, то он через какое-то время зарегистрирует прохождение этой волны через заданную точку. Ход изменения активности в этой точке будет иметь форму волны с максимумом активности. Зная рас­ стояние от точки введения (инъекции) меченого элемента до точки, в которой расположен детектор, и зная время появления максимума активности меченой волны £Макс> можно определить среднюю скорость перемещения меченого элемента на заданном участке. У меченой волны есть и передняя точка волны. Фикси­

243'

руя момент появления активности в заданной точке to, можно рассчитать максимальную скорость перемещения меченого эле­ мента на заданном участке.

Определение скорости перемещения меченых элементов в растениях показало, что эта скорость имеет порядок 1— 10 м/ч. Возникла довольно сложная теоретическая задача — объяснить такую высокую скорость переноса питательных элементов в ра­ стениях.

тальной задачей является изучение судьбы элементов,. ассими­ лируемых живыми организмами. Выше отмечалось, что с по­ мощью радиоактивных изотопов-индикаторов можно просле­ дить перенос только меченых элементов, но не их соединений. Методы регистрации излучений радиоактивных изотопов фикси­ руют присутствие только радиоактивных изотопов, и не более. Химическую форму и состояние, в котором находится радиоак­ тивный изотоп, при этом установить невозможно. Чтобы опре­ делить химическое состояние, в котором находится меченый элемент, необходимо выделить это меченое соединение и иденти­ фицировать его соответствующими методами анализа.

Изучить химическое превращение или путь меченого элемен­ та в процессе метаболизма — это значит выяснить все те цепи превращений, в которых участвует меченый элемент от момента введения в исходной химической форме, выяснить, из каких в какие соединения переходит меченый элемент, в каких коли­ чествах он накапливается в продуктах метаболизма.

Таким образом, постановка задачи включает необходимость получения как качественной, так и количественной картины пе­ реноса элементов в метаболизме. В сущности это и есть предмет исследований динамической биохимии. Только с помощью'ме­ тода радиоактивных индикаторов стало возможным решить основную задачу динамической биохимии — выяснить химиче­ ские превращения элементов в процессах метаболизма. Но для решения этой задачи одного метода радиоактивных ин­ дикаторов недостаточно. Здесь неизбежно приходится сочетать метод радиоактивных индикаторов с методами аналитической химии и биохимии — методами разделения смесей веществ и их идентификации.

В биохимии широко применяют методы грубого фракциони­

помощью которых получают неоднородные, но сравнительно близкие по химической природе фракции смесей веществ.

Конечно, сочетание метода радиоактивных индикаторов с методами грубого группового фракционирования дает лишь весьма ориентировочную информацию о превращении меченого элемента. Чтобы определить истинный путь меченого эле­

244

мента в процессе метаболизма, необходимо использовать методы разделения продуктов метаболизма на отдельные химические соединения. При этом методы фиксации живых ор­

новными методами анализа, а радиохроматографический метод стал основным методом динамической изотопной биохимии.

Радиохроматографический метод изучения химического пе­ реноса и превращения меченого элемента сводится к следую­ щему. Живой организм или приводят в контакт со средой, в ко­ торой находится меченый элемент в заданной химической форме, или в живой организм вводят меченый элемент также в задан­ ной химической форме. Через определенный интервал времени фиксируют живой организм и хроматографическим методом про­ изводят разделение продуктов метаболизма. Наиболее часто используют методы бумажной или тонкослойной хромато­ графии.

С помощью радиометрического анализа или авторадиогра­ фии выясняют, в каких именно соединениях находится меченый элемент и в каких количествах.

Фиксируя живой организм с введенным в него меченым эле­ ментом через различные интервалы времени, производя радио­ хроматографический анализ продуктов метаболизма и сопостав­ ляя результаты этого анализа, определяют переход (перенос) меченого элемента из одних соединений в другие. Таким обра­ зом можно выяснить всю цепь превращений, в которых участ­ вует меченый элемент в процессе метаболизма, начиная от пер­ вичных продуктов, в которые включается меченый элемент.

С помощью радиохроматографического метода оказалось возможным проследить цепь превращений не только углерода

вфотосинтезе, но и различных веществ в растениях, животных

имикроорганизмах в процессе биосинтеза.

Впервые доказано, что первичным свободным продуктом фо­ тосинтеза является фосфоглицериновая кислота (ФГК), а не моносахара, как предполагали ранее. Сахароза синтезируется из сахарофосфатов. Результаты радиохроматографического ис­ следования позволили Кальвину составить новую схему дина­ мики превращения углерода, ассимилированного при фотосин­ тезе (рис. 8.3).

И сследование кинетики изотопного обм ена в биологических систем ах. Выше отмечалось, что задача исследования цепи хи­ мических превращений элементов в метаболизме включает не только качественную, но и количественную картину процесса.

245

Радиометрически определяется содержание меченого элемен­ та в отдельных химических соединениях в различные моменты времени, отсчитываемого от начала введения меченого элемента в организм. По результатам радиометрических измерений строят кинетическую кривую накопления меченого элемента в составе данного химического соединения.

Для теоретического рассмотрения задачи исследования хи­ мического превращения меченого элемента в живом организме

Рис. 8.3. Схема превращения углерода, ассимированного при фотосинтезе:

продукты метаболизма можно абстрактно рассматривать как цепь ячеек, связывающих данный меченый элемент. Существует определенный путь последовательного перехода меченого эле­ мента по этим ячейкам. Совокупность ячеек, связывающих ме­ ченый элемент, направленный перенос — все это имеет, хотя и неполную, аналогию с динамикой сорбции и хроматографии. В связи с этим для исследования химического превращения ме­ ченого элемента можно использовать два способа: фронтальный

246

и элютивный. При фронтальном способе на «вход» в цепь ячеек непрерывно подается меченый элемент с заданной начальной концентрацией и в исходной химической форме. Меченый эле­ мент последовательно переходит из ячейки в ячейку и накапли­ вается в них до необходимой концентрации в соответствии с •«емкостью» ячейки.

При элютивном способе во входную ячейку подается на ко­ роткое время порция (импульс) меченого элемента, а затем немеченый элемент. Тогда через цепь ячеек начинает распрост­ раняться меченая волна или «импульс» меченого элемента. Второй способ, вообще говоря, более экономичен с точки зрения расхода радиоактивных изотопов; кроме того, он обусловливает меньшее радиационное воздействие на живой организм.

Элютивный способ дает возможность определить «минималь­ ное» время, затрачиваемое на перенос меченого элемента из од­ ной ячейки в другую, от фиксируемого продукта к конечному, ют какого-либо заданного продукта к любому другому продукту щепочки.

Элютивный способ кроме минимального времени переноса

.позволяет определить среднее время переноса. Для этого необ­ ходимо фиксировать время появления максимума концентрации меченого элемента в ячейках. Среднее время переноса меченого элемента между двумя заданными ячейками (продуктами) опре­ деляется как разность времени максимумов накопления мече­ ного элемента в заданных ячейках.

Наконец, следующей по сложности типовой задачей исполь­ зования метода изотопных индикаторов является задача иссле­ дования изотопного обмена, или, что то же самое, изотопного обновления химических элементов в биологических системах.

Для более полного и глубокого изучения метаболизма ве­ ществ необходимо контролировать в отдельных ячейках (про­ дуктах) не только кинетику накопления меченого элемента, но и кинетику содержания немеченого элемента. Тем самым можно до конца использовать преимущество метода изотопных инди­ каторов, позволяющего производить раздельный учет содержа­ ния меченого и немеченого элементов, что невозможно осущест­ вить другими методами.

Если в живой организм ввести меченый элемент, то можно получить кинетические кривые содержания в продуктах метабо­ лизма меченого и немеченого элементов.

Количество немеченого элемента определяют по разности между общим количеством химического элемента и количест­ вом меченого элемента.

При фронтальном способе ведения опыта, когда во входную ячейку подается только меченый элемент, в каждой последую­ щей ячейке постепенно увеличивается относительное содержание меченого элемента и уменьшается относительное содержание не­ меченого элемента. Кинетика общего количества химического

247

элемента в ячейке может быть сложной. Сложной может быть и кинетика меченого и немеченого элементов в каждой ячейке. Но общая тенденция увеличения относительного содержания меченого элемента и уменьшения относительного содержания немеченого элемента при фронтальном способе введения должна сохраняться.

Иначе говоря, происходит обновление химического элемента в продуктах метаболизма — немеченый элемент постепенно за­ мещается меченым.

Кинетика абсолютных количеств немеченого и меченого эле­ ментов в каждой ячейке зависит от того, преобладают в мета­

В квазистационарном состоянии обновление химических эле­ ментов каждого продукта сбалансировано, т. е. происходит эквивалентный изотопный обмен -— немеченый элемент в экви­ валентном количестве замещается меченым элементом.

В общем виде переплетающиеся цепи превращений немече­ ных и меченых элементов в процессе метаболизма описываются сложной системой дифференциальных уравнений кинетики хи­ мических реакций.

Метод изотопных индикаторов позволяет получать необходи­ мую исходную экспериментальную информацию для математи­ ческого моделирования процессов метаболизма веществ, т. е. для получения соответствующих систем дифференциальных уравне­ ний кинетики метаболизма. Решение этих систем уравнений позволяет получить количественную картину динамики распре­ деления контролируемого меченого элемента между продуктами метаболизма во времени. Теоретические предсказания, вытекаю­ щие из принятой математической модели, в свою очередь можно проверить экспериментально методом изотопных индикаторов. Экспериментальные данные могут стать основой для проверки и уточнения математической модели процесса. Таковы в общих чертах взаимосвязи теоретической и экспериментальной изотоп­ ной биохимии.

В кратком курсе нет возможности рассматривать вопросы теоретической изотопной биохимии. Это сложные и сугубо спе­

248

циальные вопросы, изложение которых требует привлечения сложного математического аппарата. Остановимся лишь на не­ которых сравнительно простых методических вопросах исследо­ вания кинетики изотопного обмена в биологических системах.

Процессы изотопного обмена в биологических системах мож­ но изучать на уровне целого организма, отдельных тканей, кле­ ток, клеточных структур, фракций соединений и индивидуальных соединений.

Экспериментальное исследование количественных закономер­ ностей кинетики изотопного обмена сводится к получению кине­ тических кривых изменения содержания в данном объекте (орга­

гических системах в зависимости от условий, в которых происхо­ дит изотопный обмен, могут происходить до конца и не до кон­ ца. Это значит, что в одних случаях может произойти полная замена меченого элемента немеченым, а в других такая замена вследствие ряда причин (медленной кинетики изотопного обме­ на, медленного выделения немеченого элемента и др.) невоз­ можна.

Если в данном компоненте системы произойдет полная за­ мена немеченого элемента меченым, то время полного обновле­

кинетики изотопного обмена может служить также количествен­

Если изучаемый компонент гетерогенен, т. е. состоит из не­ скольких разнородных по обменной скорости компонентов, то результирующая кривая накопления меченого элемента в этом сложном компоненте-объекте будет сложной.

В отдельных случаях ее можно разложить на экспоненциаль­ ные составляющие:

249