С.Дж.Перт
.pdfГлава 1
ВВЕДЕНИЕ
1.1. Природа микробной культуры
Культивирование микроорганизмов и клеток различных тка
ней связано с особенностями роста и функций живой материи
из всех трех царств: царств животных, растений и микроорга
низмов. Термин микробы используется обычно как тривиальный
синоним слова микроорганизмы, к которым относятся бактерии,
грибы и простейшие (Protozoa). Культурами тканевых клеток
называют культуры, полученные из растений или животных.
Разные культуры крайне различны по форме и сложности.
Простейшей формой культуры является гомогенная суспензия
организмов одного типа в водной среде, поддерживаемая в по стоянных физических условиях и содержащая минимальное число определенных компонентов. К сложным культурам отно сятся культуры, содержащие более одного типа организмов, множество различных субстратов и ингибиторов. В сложных
культурах среда гетерогенна, а физические условия меняются.
Теоретические основы поведения культуры пока что известны в основном только для прос;тей.шей формы культуры. Чтобы пол ностью установить теоретические основы, необходимо прежде исследовать влияние полного диапазона всех условий на все
типы организмов не только качественно, но и количественно.
1.2. Историческое развитие
Можно проследить, что основной поток работ, посвященных
исследованию культивирования микроорганизмов начинается с
1830 г., когда Каньяр де Латур, Кютцинг и Шван открыли, что
в брожении вина и вообще в бродильных процессах повинен
рост дрожжей и других микроорганизмов. Химики во главе с Либихом противились этой идее целые десятилетия. В дальней
шем в этой области не было никакого прогресса вплоть до
1850-х годов, когда Пастер начал свои фундаментальные иссле
дования. Пастер исследовал физиологию дрожжей и бактерий,
ввел асептические методы, минимальные среды и приступил к
изучению пищевых потребностей и роли кислорода.
Первая полная среда определенного состава была получена
Ролэном [272] в 1869 г. для культивирования грибов видов
12 |
Глава 1 |
Aspergillus. Работа Ролэна была совершенной в том отношении,
что он определил пищевые потребности не только качественно,
но и количественно, выразив их в виде выхода биомассы (эко номического коэффициента). Этой количественной стороной
вопроса, к сожалению, пренебрегали во всех последующих ис следованиях пищевых потребностей микроорганизмов.
В 1870-х годах Кох ввел метод чистых культур, гарантиро вавший, что инокулят содержит только известные виды бакте
рий.
Говоря о замечательных работах Пастера, проведенных им до 70-х годов прошлого столетия, необходимо отметить, что в распоряжении Пастера не было метода чистых культур, даю
щих исследователю большие преимущества. Возможно, воспро изводимость результатов Пастера зависела от элекгивносги его культуральных сред, обеспечившей достаточное постоянство
микробной популяции. Работами Пастера и его ученика Ролэна
была установлена потребность в главных и второстепенных
компонентах среды (разд. 12.l) и в источниках энергии. По
требность в сложных органических веществах, теперь называе
мых «факторами роста», впервые была обнаружена Вильдье [345] в 1901 г., когда он открыл витамин В, или факторы «биос»,
необходимые для роста дрожжей.
В тридцатых годах с введением метода колб на качалках
Клювером и Перквином [ l 73] началось развитие более сложной
аппаратуры культивирования. Это дало возможность применять
лабораторный метод для аэрации глубинных культур, особенно для глубинных культур аэробных грwбов, которые раньше вы
ращивались только на поверхности твердых или жидких сред.
В поверхностных культурах окружение организма гегерогенно,
а в глубинных - гомогенно, поэтому проще для изучения и кон
троля. Впоследствии глубинные культуры аэробных грибов
сыграли значительную роль в развитии промышленного произ
водства антибиотиков. Возрастающее технологическое значение
культуры микроорганизмов значительно стимулировало интерес
инженеров к этой области и привело в 40-50-х годах к созда
нию ферментеров полного смешения с автоматической регуля цией условий среды. В настоящее время такое оборудование
играет центральную роль при изучении поведения культур
микроорганизмов и тканевых клеток.
До 1950 г. исследование кинетических закономерносrей куль
туры занимало незначительное место. Слейгор [300] выдвинул
концепции о взаимосвязях различных параметров культуры.
Хиншельвуд [138] предложил ценные модели кинетики реакций
в живой клетке. Моно [216] в своей монографии, явившейся
значительной вехой в исследовании кинетики, показал, как
можно охарактеризовать рост бактерий с помощью экономиче-
Введение |
13 |
скоrо коэффициента, удельной скорости роста и концентрации
лимитирующего рост субстрата. Из этого аналитического под
хода в дальнейшем [217, 227] последовало развитие теории
непрерыщюго культивирования хемостатного типа. В настоящее
время хемостатная культура имеет существенное значение для
объяснения взаимоотношений между организмом и средой.
Примерно с 1950 г. отмечается быстрое развитие методов культивирования животных клеток, чему особенно способство
вало появление монослойных и суспендированных культур, дис
пергирование клеточных культур трипсином, а также выяснение
пищевых потребностей клеток. Культуры растительных клеток
в меньшей степени привлекали внимание исследователей, коли
чественная оценка результатов их исследования кажется менее
надежной, чем в случае культур животных клеток.
Теория культивирования микроорганизмов развивалась
крайне медленно по сравнению с теоретическими основами фи зики, химии или экономики, каждая из которых благодаря огромному числу крупных исследователей уже до 1900 r. пере росла в самостоятельную область знаний.
Такое отставание в развитии теории культивирования объяс
нялось отнюдь не тем, что реакция клеток на условия среды,
как мгновенная, так и длительная, представляла меньший ин терес. Изучение открытых систем, среди которых наиболее
важной является хемостат, открыло с 1950 г. новые горизонты
как для теоретического развития этих вопросов, так и для
экспериментальной проверки теории.
Глава 2
ПАРАМЕТРЫ РОСТА И АНАЛИЗ ДАННЫХ О РОСТЕ
2.1. Параметры
Для многих целей вполне достаточно качественной харак
теристики роста, т. е. простого наблюдения, имеет ли место
вообще рост в культуре. Дальнейшую информацию, которую
получают, измеряя рост количественно, обычно выражают в
форме графика зависимости биомассы от времени.
Однако результаты количественного изучения роста могут
быть представлены более информативно и точно, если анализи
руются различные параметры роста: удельная скорость роста
или время удвоения биомассы, лаг-период, или фаза задержки
роста, экономический коэффициент, метаболический коэффи
циент, характеризующий использование субстрата и образова ние продукта, сродство субстрата и максимум биомассы.
При определении параметров роста исследуют рост простой гомогенной периодической культуры. Предполагается, что такая система состоит из хорошо перемешиваемой засеянной среды. Предполагается также, что перемешивания достаточно для дис
пергирования биомассы и что в среде нет перепада концентра
ций. Конечно, гетерогенная культура, например, растущая на
поверхности, имеет более сложную природу (гл. 23).
2.2. Скорость роста
2.2.1.Удельная скорость роста
Для роста биомассы в культуре необходимы следующие ус ловия: а) жизнеспособность засева; б) наличие источника энер
гии; в) внесение пищевых добавок, содержащих все компонен
ты, необходимые для синтеза биомассы; г) отсутствие в среде
ингибиторов, подавляющих рост клеток; д) поддержание в
среде подходящих физико-химических условий.
Если удовлетворены все эти требования, то предполагается,
что в течение бесконечно малого промежутка времени dt увели
чение биомассы dx должно быть пропорционально количеству
биомассы х и интервалу времени, т. е.
dx=µxdt, |
(2.1) |
Параметрь1 роста и анализ данных о росте |
15 |
откуда |
|
dx/di= µх. |
(2.2) |
Дифференциальное отношение dx/dt выражает скорость |
роста |
популяции. Параметр µ, обозначающий скорость роста единицы
биомассы (l/x) |
(dx/dt), называется -удельной |
скоростью |
роста |
~ измеряется в |
единицах, обратных времени |
( l/t). Этот |
пара |
метр аналогичен сложным процентам. Так, например, удельная
скорость роста О, l ч-1 |
эквивалентна скорости l О% в |
l ч. |
||||
Если |
µ постоянна, |
то интегрирование уравнения |
(2.2) дает |
|||
|
|
|
lп х = ln х0 + µt, |
|
(2.3) |
|
где хо - |
биомасса в |
начальный момент времени t = О. |
График |
|||
зависимости lп х от |
времени будет иметь вид прямой |
линии с |
||||
наклоном µ. Приведя логарифмы к основанию 10, |
из |
уравне |
||||
ния (2.3) |
получаем |
|
|
µt |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
lgx= |
2,30 +Igx 0• |
|
(2.4) |
Из уравнения (2.3) |
следует, что |
|
|
|||
|
|
|
lп (х/Хо) = µt. |
|
(2.5) |
|
Тогда |
|
|
|
x=x 0eµt. |
|
(2.6) |
|
|
|
|
|
Рост, подчиняющийся этому закону, называется экспоненциаль
ным, или логарифмическим ростом. Основным параметром ха
рактеризующим скорость роста, служит удельная скорость
роста. Остальные параметры роста, которые рассматриваются
ниже, могут быть выражены через удельную скорость роста.
2.2.2. Время удвоения биомассы
Зависимость между удельной скоростью роста и временем удвоения (td) биомассы можно получить, подставив в уравне
ние (2.5)
х=2х0 и
Тогда
(2.7)
2.2.3. Степень размножения
Степень размножения определяется отношением х/х0, которое равно eµt [см. уравнение (2.6)]. С другой стороны, если био
масса претерпевает п удвоении или генераций, мы можем запи
сать
(2.8)
16 |
Глава 2 |
|
Таким образом, |
п = 3,32 log (х/х0). |
(2.9) |
|
В экспериментах по культивированию целесообразно использо вать засев, количество которого составляет 10% конечного
количества биомассы. Тогда п будет равно 3,32.
2.2.4. Обратное время удвоения
Поскольку число удвоений биомассы за время t будет равно t{fd, мы можем записать
х=хо2t/t d, |
(2.10) |
Взяв логарифм по основанию 2 от обеих частей уравнения
(2.10), получим
(2.11)
Наклон графика (l/td) зависимости log х от времени и есть обратное время удвоения. Некоторые исследователи предпочи тают выражать скорость роста через l/td, а не через удельную
скорость роста. Однако µ кажется нам предпочтительнее, по
скольку этот член входит в основное уравнение (2.2) роста. Об
удобстве этого показателя свидетельствует универсальность его
применения в теории непрерывного культивирования. Важно
четко представлять, какого из этих двух способов следует при
держиваться.
2.3. Справедливость закона экспоиенциального роста
Закон постоянного экспоненциального роста выполняется, если условия окружающей среды и состав биомассы остаются
постоянными. Другими словами, если скорость роста не подчи
няется этому закону, то не выполняются либо одно, либо оба
из вышеуказанных условий. Наличие экспоненциальной фазы
роста хорошо известно в случае бактериальных и дрожжевых
культур, но закон постоянного экспоненциального роста уни
версален и для всех прокариотов и эукариотов при условии, что
указанные выше условия выполняются. Справедливость закона
применительно к простейшим продемонстрировал Филпс [238],
а применительно к животным клеткамБерч и Перт [21]. Перт и Каллоу [258] установили, кроме того, применимость экспо
ненциального закона к культурам плесневых грибов в гомоген
ной перемешиваемой культуре. Рост нитчатых грибов может отклоняться от экспоненциального, что может объясняться либо образованием шаровидных колоний, в которых биомасса рас
предел.ена ие гомогенно в среде, либо тем обстоятельством, что
Параметры роста и анализ дант,1х о росте |
17 |
доставка кислорода становится лимитирующим фактором. Из
менения в окружающей среде, пожалуй, чаще всего являются
основной причиной, из-за которой не удается поддерживать постоянным экспоненциальный рост. Это неизбежно происходит
в периодической культуре - раньше или позже. Вероятно, в
дальнейшем изменения в окружающей среде вызовут сооrвет
ствующие изменения в составе биомассы. Как будет показано в гл. 24, уже из простой модели роста биомассы следует, что в
ответ на изменение условий соотношения различных компонен
тов биомассы будут автоматически подстраиваться так, чтобы скорость роста была максимальна в данных условиях.
2.4. |
Экономический коэффициент |
|
Экономический |
коэффициент (или |
выход биомассы)· опреде |
ляют из уравнения |
|
(2.12) |
|
Лх/Лs=У, |
где Лх - увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве Лs. Более строго экономический коэффи
циент определяется пре:П.елом, к которому стремится отношение
ЛХ/Лs при Лs-+ О, т. е.
Y=dx/ds. |
(2.13) |
Следует отметить, что если х и s - концентрации биомассы и
субстрата соответственно, то
Y=-dx/ds.
Знак «минус» вводится потому, что значения х и s изменяются
в разные стороны.
Важность экономического коэффициента состоит в том, что
он выражает количественные потребности организма в пище.
Экономический коэффициент был использован Ролэном [272]
для выражения пищевых потребностей грибов. Последующие
исследователи-микологи имели тенденцию использовать величи
ну, обратную У, называя ее экономическим коэффициентом 1•
В 1942 г. Моно [216] впервые показал, что если внешние усло
вия в бактериальной культуре поддерживаются постоянными, то экономический коэффициент тоже будет постоянной, количе ственно воспроизводимой величиной. Таким образом, если х0 и
so - начальные |
концентрации биомассы и субстрата соответст |
||
венно, _а х и s - |
соответствующие концентрации во время |
роста |
|
в культуре, то |
х - Хо= У (so- s). |
|
|
|
|
(2.14) |
|
|
|
|
|
1 В советской литературе термином «экономвческий коэффщиент» обо
значают не 1/У, а У. - Прим. ред.
18 |
Глава 2 |
Когда биомасса достигает своего максимума Хт, концентрация лимитирующего субстрата равна приблизительно О (s ~ О), т. е.
мы можем записать
Хт-Хо=Уs0• |
(2.15} |
Следовательно, для лимитирующего субстрата график зави
симости Хт от so должен быть прямой линией с тангенсом угла
наклона, равным У. На рис. 1 изображен пример применения
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
Сооержание холинхлорui!а, мк:г/.мJt,
Рис. 1. Влияние концентрации холина на рост культуры LS-клеток мыши.
Точками иа графике обозиачены средние значения. Вертикальные линии соответствуют
разбросу данных (20].
этого отношения для определения экономического коэффициента при культивировании животных (мышиных) клеток в среде с
холином.
2.5. Метаболический коэффициент
Скорость потребления субстрата культурой в данный момент
времени выражается отношением
ds/dt=qx, |
(2.16) |
где х - биомасса, а коэффициент q известен как метаболический коэффициент, или удельная скорость метаболизма. В качестве
хорошо известных примеров можно привести q0 , и qглюк для
потребления кислорода и глюкозы соответственно. Метаболиче
ский коэффициент аналогичен ферментативной активности. Если состав биомассы и окружающая среда постоянны, то и q дол
жен быть величиной постоянной.
Параметры роста и анализ данных о росте |
19 |
|
Для потребления субстрата в небольшой промежуток време |
||
ни dt мы можем записать |
j dt, |
|
ds= |
(2.17) |
|
откуда |
= µxfY. |
|
ds/dt |
(2.18) |
|
Сравнивая уравнение (2.18) и (2.16), видим, что |
|
|
q=µfY. |
(2.19) |
Уравнение (2.19) используется для определения потребностей
всубстрате, особенно в кислороде, при различных скоростях
роста.
В гл. 16 будет рассмотрено применение метаболического коэффициента для определения скорости образования продукта.
2.6. Влияние концентрации субстрата ка скорость роста
Существование фазы экспоненциального роста в периодиче
ской культуре доказывает, что скорость роста может в довольно
широких пределах не зависеть от концентрации субстрата. Сле довательно, рост в этом случае характеризуется кинетикой нуле
вого порядка. Можно предположить, что кинетика потребJiения
субстрата будет соответствовать кинетике ферментативной реакции. Тогда, если s - концентрация субстрата, а q - мета болический коэффициент, то
q = QтS/(s + К8), |
(2.20) |
где Ks, называемая константой насыщения, эквивалентна кон
станте МихаэлисаМентен, а Qт - максимальное |
значение q, |
|
полученное при s» Ks, |
значения q и Qт из уравнений |
|
Подставив в уравнение (2.20) |
||
q = µ/У И Qm= µт/У, получим |
+К8), |
|
µ = µms/(s |
(2.21) |
Уравнение (2.21) часто называют отношением Моно, так как именно Моно в l 942 г. [216] эмпирически установил, что это
выражение хорошо соответствует зависимости скорости роста
бактерий от концентрации субстрата (рис. 2). Значение К., об
ратно пропорционально сродству организма субстрату. Преобра зуя уравнение (2.21), получаем
(2.22)
т. е., построив график зависимости l/µ от 1/s, получим прямую
линию, которая пересекает ось абсцисс в точке -l/Ks, а ось