С.Дж.Перт
.pdfДействия химических ингибиторов и активаторов роста |
221 |
Из уравнения (17.40) следует, что |
|
Ка= [Х][А]/[ХА], |
(17.44) |
где квадратные скобки означают концентрации. Предполагаем, что общую скорость реакции (V) ограничивает скорость распада комплексов XS и XAS в продукт, т. е.
V = k [XS] + k' [XAS] = qx, |
(17.45) |
где q - удельная скорость потребления субстрата и х - общая биомасса. Если активатора нет и биомасса насыщена субстра
том, то [XS] = х и для удельной скорости потребления субстра
та qт = k. Если биомасса насыщена субстратом и активатором,
положим [XAS] = х, тогда максимальная удельная скорость поглощения субстрата дается уравнением k' = q~. Примем, что
qm= µт/Ух и q~ =µ~/Ух• где Ух - экономический коэффициент,
отсюда следует, что k'/k = µ~/µm. |
Выр.ажая [XS] и [XAS] |
через х, s, Кв и Ка, получим |
|
µ=~µms/(s+Ks), |
(17.46) |
где |
|
~=(1+~µ~)/(1-а). |
|
Ка µт |
Ка |
Таким образом, кажущееся действие активатора проявляется в
увеличении µm, значение Кв при этом не меняется.
В пользу этой модеJIИ говорит реакция клеток HeLa челове
ка на инсулин [26], поскольку при недостатке инсулина скорость
роста была очень низкой. В условиях лимитации клеток Bacil- lus магнием некоторые виды выделяют вещество, которое дейст
вует как активатор [203]. Было высказано предположение, что
этот эффект можно смоделировать при помощи выражений, ана
логичных уравнению (17.46). Примерами активаторов фермен
тов служат хлорид-ионы для активации альфа-амилазы и опре деленные двухвалентные или трехвалентные анионы для фума
ратrидратазы [84, стр. 443].
Глава 18
КУЛЬТУРЫ ПРИ НИЗКИХ
И НУЛЕВОЙ. СКОРОСТЯХ РОСТА
18.1. Поведение в стационарной фазе
Когда рост прекращается, в культуре устанавливается ста
ционарная фаза. Истинная стационарная фаза вызывается
истощением среды, химическим ингибированием роста или физическим стрессом. Фаза отмирания, характеризующаяся авто лизом и уменьшением биомассы, может наступить после
стационарной фазы или непосредственно после прекращения
роста.
Растущие вегетативные клетки теряют свою стабильность,
когда по каким-либо причинам рост останавливается. Прекра
щение роста немедленно вызывает ряд изменений |
в структуре |
|
и функциях организма. Автолиз в фазе отмирания - |
это экстре |
|
мальное проявление нестабильности организма после прекраще |
|
|
ния роста. Поведение организма в стационарной фазе, вероятно, |
|
|
не является однотипным. Проявляющаяся изменчивость карти |
|
|
ны зависит от природы лимитирующего рост субстрата или от |
|
|
условий ингибирования. |
|
|
Поскольку теоретически с помощью хемостата скорость ро |
|
|
ста культуры можно поддерживать около нулевого значения, |
|
|
возникает вопрос: как близка к нулю должна быть удельная |
|
|
скорость роста, прежде чем проявится характерное поведение |
|
|
культуры в стационарной фазе? Или поведение, характерное для |
, |
|
стационарной фазы, начинается при некоторой конечной скоро-
сти роста? Этот вопрос рассматривается в разд. 18.4.
18.2.Стационарная фаза бактериальной культуры
18.2.1.Общие свойства
Вранней стационарной фазе размер бактериальной клетки достигает минимума. В поздней стационарной фазе, или в фазе отмирания, часто наблюдаются искривленные или разбухшие
клетки, называемые «инволюционными формами». Вероятно, эту
картину вызывают либо повреждение литическими ферментами
клеточной стенки или плазматической мембраны, либо слабая регуляция остатr>чноrо синтеза клеточных компонентов. У rрам-
Культуры при низких и нулевой скоростях роста |
223 |
положительных бактерий в стационарной фазе обычно наблю
дается потеря способности клеток сохранять характер окраски
по Граму. Кроме того, сопротивляемость бактерий многим
формам физических и химических стрессов, вызванных, напри мер, гипотоничной средой, резкой, внезапной сменой температу ры на холодную или высокую, в стационарной фазе выше, чем
в логарифмической. Это означает, что структура организма в
этих двух фазах различна. Для некоторых групп бактерий в
стационарной фазе характерно образование эндоспор или экзо
спор. Даже у неспорообразующих типов есть цитологическое
свидетельство развития микроцист [23]. Они могут быть рези
стентными, покоящимися формамff бактерий.
18.2.2.Метаболизм
Характерной особенностью нерастущих организмов является
потеря ими ферментативной активности [320]. Эта потеря фер
ментов может быть вызвана обновлением белка, который резко
возрастает от уровня 0,5% и меньше в растущих бактериях до
5% в I ч, если рост прекращается [199]; однако некоторые фер
менты, кажется, исчезают со скоростью, превышающей скорость
обновления белка [320].
Эндогенный метаболизм нерастущих бактерий характеризует
тип бактерий [67]. При истощении аэробная суспензия грам
положительных бактерий одновременно окисляет пул пептидов
и аминокислот вместе с запасными углеводами. Напротив, Escherichia coli окисляет сначала некоторые запасные гликоге ны, а затем пептиды, хот~ общее количество свободных амино
кислот остается постоянным.
18.2.3. Выживаемость
Если бактерии, суспендированные в культуральной среде,
испытывают голодание по какому-либо элементу, необходимому для роста, то они постепенно отмирают. Если таким элементом
является источник углерода или энергии, то при его добавлении
отмирание бактерий ускоряется. Это явление называется «уско
рение отмирания субстратом» [265, 310]. Этот эффект снимается
спомощью I мМ циклического АМФ [39].
Спомощью меченой по 14С биомассы было показано, что
добавление углеродных субстратов к суспензии водорослей, пле сенеsого гриба и дрожжей в буферном растворе стимулирует
. распад эндогенных субстратов [211, 218]. Возможно, что это
способствует «ускорению отмирания субстратом».
Поддержание жизнеспособности стрептококков в нерастущих
водных суспензиях повышается с помощью ионов магния [319].
224 |
Глава 18 |
i(роме того, жизнеспособность клеток может увеличиться при
наличии резервных источников энергии в клетке [310].
18.3.Стационарная фаза в культурах грибов
18.3.1.Без источников углерода и энергии
Тринси и Ригелато [330] вызвали наступление фазы отмира
ния или автолиза в хемостатной культуре у Penicillium chryso-
genum в стационарном состоянии, прекратив подачу глюкозы.
Автолиз, начинавшийся без лаг-периода, характеризовался
уменьшением сухого веса мицелия с постоянной скоростью 8%
в I ч. Содержание белка и РНК уменьшалось сначала со ско
ростью 5% в I ч, но через 6 ч убыль была |
более |
медленной. |
||
Общее содержание углеводов в течение 48 |
ч не |
изменялось, |
||
но затем уменьшалось |
со скоростью |
0,5% в |
1 ч. |
Содержание |
ДНК падало на 75% за |
12 ч, а потом |
оставалось приблизитель |
||
но постоянным. Было показано, что основания нуклеиновых кислот накапливались в среде. Гифы теряли значительную часть цитоплазмы, выходившей через стенки гиф, и набор мембран,
вероятно, из органелл. Через 5 дней оставалось немного нор
мальных фрагментов гиф, никаких конидий не образовывалось,
как это было в случае подкормки глюкозой (разд. 18.3.2). В пе
риодической культуре, лимитированной глюкозой, автолИ3 начи нался, когда экспоненциальная фаза резко прекращалась из-за
истощения источника энергии.
18.3.2. При добавлении источника энергии, расходуемого на поддержание
Действие ограниченного добавления глюкозы на процессы
поддержания в хемостатной культуре Penicillium chrysogenum
исследовали Ригелато и др. [275]. Рост культуры был лимити
рован глюкозой. В течение первых 12 ч содержание белка, РНК и ДНК интенсивно уменьшалось. Впоследствии содержание белка оставалось приблизительно -постоянным, а РНК и ДНК
синтезировались вновь, и их количество превосходило исходное
значение. Содержание общих углеводов несколько увеличива лось. Дыхательный коэффициент падал от 0,97 до 0,72, свиде
тельствуя о том, что главные изменения происходили в окисли
тельном метаболизме.
После 24 ч погруженные гифы образовывали конидии с
достаточно высокой постоянной скоростью, поддерживающиеся
в течение 120 ч.
Если рост Aspergillus nidulans прерывали, прекратив добав ление в хемостат глюкозы, то наблюдаемые в культуре измене-
226 |
Глава 18 |
дифференцируется в покоящиеся клетки. Эта часть характери•
зуется временным прекращением роста, минимальным содержа
нием РНК и ДНК (около 6 и 2% сухой биомассы соответствен
но), минимальной или нулевой энергией поддержания и наличием
лаг-периода перед началом индукции ~-галактозидазы. Отсюда
следует, что для определения истинной удельной скорости роста
при малых скоростях роста необходимо определить долю «поко ящейся» популяции, а не просто долю жизнеспособных клеток.
Постулированная дифференцировка в покоящиеся клетки могла
бы дать возможность растущей части популяции поддерживать
минимальную скорость роста.
18.5. Кинетика спорообразования у Bacillus
Образование эндоспор у Bacillus обычно связывают со ста◄
ционарной фазой периодической культуры, однако с помощью хемостатной культуры было показано, что между спорообразо
ванием и скоростью роста существует негативная корреляция
[69]. Ниже мы рассмотрим модель Дооза и Торнлея [69], объ
ясняющую кинетику спорообразования.
Предполагается, что в культуре происходят следующие про
цессы: I) размножение вегетативных клеток, 2) инициация об разования спор, 3) созревание спор и 4) прорастание созревших
спор в вегетативные клетки. Считается, что раз инициация спо
рообразования произошла, то организм должен пройти весь последовательный ряд превращений до созревания споры. Если
мы обозначим вегетативную клетку Х, инициированную спору У, а зрелую спору- Z, то все четыре процесса можно предста вить соответственно следующим образом:
1) Х -- |
2Х, 2) Х -- У, 3) У -- |
Z, 4) Z -- |
Х. |
Далее предположим, что процессы l, 2 и 4 являются реакциями
первого порядка с константами скорости µ, К и сх. соответствен
но. Положим п, у и ~ - число вегетативных клеток, иницииро ванных и зрелых спор в единице объема соответственно, а tm- время с момента инициации спорообразования до созревания
споры.
В периодической культуре, в бесконечно малый интервал
времени dt увеличение числа вегетативных клеток в единице
объема будет
Общее |
= |
|
Споры |
Споры |
увеличение |
Рост |
инициированные + созревшие, |
||
или |
|
dn=,µndt - Kndt + a.~dt. |
(18.1) |
|
|
|
|||
