С.Дж.Перт

венных за оверхсинтез глутаминовой кислоты клетками Coryne- bacterium glutamicus. Недостаток биотина вызывает, вероятно,

увеличение мембранной проницаемости для глутаминовой кис­

лоты, поэтому указанная аминокислота не способна удержи­

ваться в клетке [169, стр. 314]. Лимитация роста LS-клеток

мышей в культуре холином или инозитом вызывала образование

почкообразных выступов на клетках, что наводит на мысль о

повреждении мембран (Блейнер, Товей и Перт, неопубликован­

ные данные).

Между витаминами возможен антагонизм, например между

тиамином и пиридоксалем у дрожжей [302]. В настоящее время

еще мало данных об ингибирующем действии витаминов на рост, однако известно, что фолиевая кислота или формилтетраrидро­

фолиевая кислота в количестве 0,01 мкг/мл полностью подав­

ляет рост Lactobacillus bulgaricus [280].

Не исключено, что любой из компонентов клетки способен

выполнять роль ростового фактора. Важными факторами роста

являются пурины, пиримидины, гемин [178] и полиамины, пут­

ресцин, спермин и спермидин [56].

Изучение роли гормона инсулина, необходимого для клеток

человека HeLa в культуре [26], и гормона 2,4-дихлорофенокси­

ацетата, в котором нуждаются культуры клеток растений [355],

показало, что эти гормоны действуют подобно факторам роста

в среде для культивирования.

Потребность клеток HeLa в инсулине может быть достаточно легко исключена. Эrо видно из того факта, что клетки, взятые из сложной среды, проявляют признаки потребности в инсулине (что заметно по падению скорости роста) только после 13 гене­ раций. Подобное наблюдение дает основание думать, что по­

требности в факторе роста могут иногда проявляться скорее

через уменьшение скорости роста, чем через уменьшение эконо­

мического коэффициента.

12.5. Потребности в фосфоре

Фосфор обычно вносят в среду в виде неорганических фосфа­ тов. Кроме того, можно использовать органические фосфаты, та­

кие, как глицерофосфат и фосфолипиды. Фосфор входит в соста,в

нуклеиновых кислот, фосфолипидов, полимеров клеточной стен­

ки; иногда он накапливается в клетке в виде полиметафосфата

[202].Только небольшая часть общего фосфора обнаруживается

вформе легко диффундирующих органических фосфатов, таких,

как АТФ.

Содержание фосфора в бактериальных клетках равно при­

близительно 1,5% веса сухой биомассы, однако содержание его

увеличивается со скоростью роста и изменяется обратно темпе­

ратуре. Эти изменения в значительной степени отражают содер­

жание РНК в клетке [315]. У бактериальных клеток существует

стехиометрическое соотношение между количествами магния,

калия, фосфора и РНК, котоQое является характерным для

различных групп бактерий [315J. Для rрам-отрицательных бак­

терий молекулярное соотношение Mg: К: РНК--нуклеотид: РО, близко к 1 : 4: 5: 8 и не зависит от скорости роста, температуры и субстрата, лимитирующего рост. Для грам-положительных бактерий соотношение Mg: К : РНК-нуклеотид: РО. составляет приблизительно 1 : 13: 5: 13, за исключением тех случаев, когда рост лимитируется фосфатом и соотношение становится около 1 : 4: 5: 8, т. е. то же самое, что и для rрам-отрицательных бак­

терий. Более высокое содержание фосфата и калия в rрам-поло­ жительных бактериях объясняется наличием в их клеточных стенках тейхоевой кислоты, содержащей в избытке фосфаты.

Однако во время роста грам-положительных бактерий при ли­

митаuии фосфором полимер тейхоевой кислоты заменяется тей­ хуроновой кислотой, не содержащей фосфат.

12.6. Потребности в калии и натрии

При образовании биомассы микроорганизма потребность в калии соответствует выходу биомассы и приблизительно состав­

ляет 60 r сухой биомассы на 1 r калия. Большая часть калия, вероятно, связана с РНК [315], так что потребность в калии

увеличивается под влиянием тех факторов, которые, подобно

скорости роста, ведут к увеличению содержания РНК в биомас­

се. Потребность в калии может меняться обратно изменению рН,

так как для Klebsiella найдено, что содержание калия увеличи­

валось приблизительно на 30% в клетках при снижении рН

среды от 7 до 6 [88]. Содержание калия в некоторых бактериях

увеличивалось в 3 раза при увеличении количества хлористого

натрия в среде [318]. Для того чтобы начался рост клеток мле­

копитающих в культуре, необходимо было превысить нижнюю пороговую концентрацию ионов калия (4 · 10-• М), а для дости­

жения максимальной скорости роста концентрация ионов калия

в среде -должна была быть не ниже 5,3 · 10-• М [22]. Кажется,

что такая пороговая концентрация для питания клеток млеко­

питающих ионами калия и магния является очень высокой.

Только один щелочной металл способен заменить собою ка­

лий - это рубидий [89], хотя такая замена снижает максималь­

ную скорость роста. Действие ионов калия может тормозиться

ионами аммония [81]. Ионы калия способны выполнять роль

коферментов и, возможно, играть роль катионов в структуре

РНК и других анионных структурах в клетке.

Потребность в ионах натрия для роста микроорганизмов

констатируется редко, но, возможно, это объясняется трудностью

получения сред; не содержащих ионов натрия. Большую потреб­

. ность в ионах натрия испытывают, вероятно, галофильные бак­

терии. Необходимость натр·ия как микроэлемента рассматрива-

12.7. Потребность в магнии

Экономический коэффициент в расчете· на ионы потреблен­ ного магния варьирует от 300 до 900 r сухой биомассы в расче­ те на 1 r магния и обратно пропорционален количеству РНК в

биомассе [315]. В водорослях магний входит в состав хлорофил­

ла. Для того чтобы начался рост клеток млекопитающих в куль­

туре, необходимо было превысить в среде нижнюю пороговую

концентрацию (5 • 10-5 М Mg 2+) магния, как и в случае калия,

а для достижения макоимальной скорости роста концентрация

магния должна быть 2 · 10-• М Mg2+.

Характерной особенностью недостатка магния в хемостатной

культуре Agrobacterium tumefaciens является то, что лимит маг­

ния вызывает большие колебания в концентрации биомассы

отражающие колебания в скорости роста [181].

12.8. Потребность в сере

Экономический коэффициент в расчете на потребленную

.серу составляет приблизительно 300 r сухой биомассы в расчете на 1 r серы. Сера обычно вносится в среду в форме одного из

неорганических веществ, в частности сульфата, или· в виде

цистеина или метионина. При аэробных условиях цистеин почти

нацело превращается в цистин, однако последнее вещество спо­

собно заменять цистеин.

Потребление источников серы идет с использованием их

главным образом для .снабжения серой синтеза аминокислот­ L-цистеина и L-метионина. Меньшие количества источников

. серы требуются для образования сульфогрупп в некоторых ко­

ферментах, таких, как биотин, кофермент А, ферредоксин, ли­

поевая кислота и тиамин. Лимитация роста серой может вызвать

уменьшение синтеза этих ключевых серусодержащих комllонен-

- тов и повлиять на их функции в клетке. Например, в культуре

дрожжей, рост которых был лимитирован серой, происходила потеря одного из пунктов окислительного фосфорилирования в

дыхательной цепи; этот эффект был аналогичен тому, который

. наблюдался при лимитации роста дрожжей железом [187].

12.9.Микроэлементы

12.9.1.Общие вопросы влияния микроэлементов

Микроэлементы, необходимые для роста, а также микро­

элементы, необходимость которых предполагается, указаны в

табл. 12. Эти элементы располагаются в порядке атомных

номеров от 4 (бериллий) до 74 (вольфрам), но почти все входят

Таблица 12

Микрозпементы, которые могут быть необходимы дпя роста микроорганизма ипи купьтуры-кпеток [7, 152, 306, 315) 1)

А Элементы, обычно необходимые для роста

Са. Mn, Fe, Со, Си, Zn

ВЭлементы, редко требуемые для роста

В, Na, А\, Si, С!, V, Cr, Ni, As, Se, Мо, Sn, 1

В Элементы, которые, вероятно, редко требуются для роста

Ве. F, Sc, Ti, Ga, Ge, Br. Zr, W

1) В каждой группе элементы расположены в порядке увеличения атомного числа.

в группу с атомным номером от 4 до 35. В основном потребно­

сти в микроэлементах установлены только в качественном отно­

шении, и по этой причине они почти неизменно вносятся в среду в произвольном количестве. Как правило, трудно констатиро­ вать потребность организма в микроэлементе, так как очень

часто микроэлементы присутствуют в достаточных количествах

в среде как примеси составляющих ее ингредиентов. Предприня­

тые попытки определения экономического коэффициента в отно­

шении микроэлементов наводят на мысль, что величина такого

экономического коэффициента изменяется в очень широком

диапазоне в зависимости от скорости роста и других условий

[187]. Приближенная оценка количественных потребностей в

более или менее важных микроэлементах следующая (r элемен­

Недостаток микроэлементов в периодической культуре, воз­ можно, отражается в большей степени на лимитации скорости роста, чем на количестве выросшей биомассы, как это показано

на рис. 45, А. Такой результат был получен для Agrobacterium tumefaciens [182] при росте на ср,еде с недостаточным содержа­

нием железа и для клеток млекопитающих - также на среде с

недостаточным содержанием железа [21]. В хемостатной куль­

туре ограничение микроэлементами вызывало уменьшение коли­

чества биомассы в стационарном состоянии с увеличением ско-

росте, однако недостаток селена не оказывает влияния на рост

указанной бактерии [92].

Ионы никеля необходимы для Hydrogenomonas, получающе­ го энергию в процессе окисления водорода [16].

Молибден, вносимый в виде молибдата, является кофакто­

ром бактериальной нитрогеназы, которая фиксирует азот, и нитратредуктазы, участвующей в ассимиляции нитратного азота

бактериями и грибами. Ванадий оказался менее эффективным

при замене им молибдена.

Иодид-ионы необходимы для роста видов Candida на средах

с к-парафинами [288].

Знания о потребностях организмов в микроэлементах и о

влиянии их недостатка в среде совершенно необходимы для

обеспечения их содержания в средах для культивирования.

12.10. Удаление .микроэлементов из сред

Микроэлементы могут быть удалены из раствора путем

осаждения в виде гидроокисей, фосфатов или ~арбонатов [306]

или как ферроцианиды [51]. Другими методами являются: экст­

ракция растворителем с органическими комплексонами в не­

полярной фазе [85), абсорбция на окиси алюминия [271) и

образование хелатов с помощью смол [225]. Эффект дефицита

микроэлементов можно иногда вызвать простым добавлением металлхелатирующего агента к среде, например, дефицит же­

леза, стимулирующий сверхсинтез рибофлавина некоторыми

дрожжами, достигается внесением в среду о-фенантролина [76, 77]. Методы удаления из сред металлоидов еще предстоит раз­ работать.

12.11. Связывание в хелаты ионов металлов

12.11.1. Введение

По всей вероятности, в любой среде концентрации ионов ме­

таллов, кроме ионов щелочных металлов, изменяются в резуль­

тате образования хелатов, так как многие обычные компоненты сред и продукты метаболизма, такие, как аминокислоты и окси­

кислоты, способны образовывать комплексы с ионами металлов.

Чтобы предотвратить осаждение микроэлементов и регулировать

.их концентрацию, необходимо хелатирование ионов металлов добавлением определенного агента. Металлхелатирующие веще­

ства, относящиеся к многоосновным кислотам, например

этилендиаминтетрауксусная кислота, дейrтвуют как буфер.

12.11.2. Устойчивость хелатов металлов

Ион металла (М) обратимо связывается с лигандом (L), со­

гласно уравнению

М+ L () ML,

где заряд катиона и лиганда опускается. Константа стабильности

компонента определяется из уравнения

где квадратные скобки означают концентрации реагирующих

веществ. Константа стабильности обратна константе диссоциа­

Пусть Lu - сумма всех комплексообразующих агентов, не