Микра_Практ
.pdf
42
гут прикрепляться к субстрату; есть одиночные и колониальные формы
(рис. 17).
Рис. 17. Простейшие:
1 - амеба; 2 - инфузоршi: 3 - сувой1<и
Задание
Ознакомиться с морфолоmей простейших. Приготовить препарат
из активдого ила. При приготовлении препарата «висячая капля» взять пипеткой осадок, содержащий активный ил. Найти и зарисовать пред
ставителей простейших: амеб, инфузорий различных подклассов Para-
mecium caudatum(инфузория-туфелька), Vorticella convallaria(оувойка).
Зарисовать зооглей бактерий. Объектив 1Ох. ·
Тема 3. Строение клеток микроорганизмов
Важнейшими методами изучения общей организации и тонкой
структуры клетки являются микроскопия,. особенно электронная .в соче
тании со сложной предварительной обработкой биолоmческого мате
риала,· а также биохимические исследовани'!'. вЬiделенных отдельных органелл и фракций клеток методом дифференциального центрифуги
рования.
Изучение строения микробных клеток на уровне светового микро
скопа возможно при использовании цито- и гистохимических методов
окраски. Используют, как правило, анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Наибольшее применение имеют основные кра сители (красящая группировка - хромофор - катион): красные (сафра
нин, фуксин -основной, гематоксилин); фиолетовые (генциан фиолето-
43
вый, крж:та.лличесхий фиолетовый и т. д.'); синие (метиленовый синий,
викторЮI); коричневые (кризоилии, незурии); зеленые (янус зеленый) и
черные (индулин): '
Реже применяют нейтральные красители (нейтральный красный) и кислые красители (эозин).
К кислым красителям относятся красные (фуксин кислый, эритро
зин), желтые (конго, пикриновая кислота), черные (нигрозин). Из на
званных красителей готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные рас
творы.
Различают следующие виды гистохимической окрасkИ:
-простое окрашивание - диффузная окраска каким-либо раствором
красителя всей клетки;
сложное окрашивание - дифференциальная окраска отдельных
структур, органоидов, включений клетки под воздействием двух
красящих веществ, из которых 9дио - основное, а другое дополни
тельное - контраст.
позитивное окрашивание - непосредственная окраска клетки или
отдельных структур, органоидов, включений;
негативное .окрашивание - окраска пространства вокрут клетки, в
результате чего клетка выглядит силуэтом на фоне красителя;
прижизненное окрашивание (витальное) - окраска живых клеток
микроорганизмов;
-окрашивание фиксированных клеток - окраска убитых клеток мик
роорганизмов.
Живые микроорганизмы прокрашиваются значительно Ч'Уднее,
чем те же ми~рганизмы, фиксированные различными способами.
Окрашивание происходит лишь только после того, как нарушается про
ницаемость стенки и цитоплазматической мембраны.
·Работа 7. OnpeAeneн"e размеров клеток
Размеры микробных клеток варьируют _в широких пределах: от со тых долей микрОМС'IрОВ (мкм) у некоторых бактерий до нескольких де сятков и сотен микромС'IрОВ у микроскопических простейших и водо рослей.
Определение размеров клеток микроорганизмов под микроскопом включает три этапа: определение размеров клеток в делениях окулярной линейки, определение цены деления окулярной линейки в мкм и расчет
размеров клеток в мкм.
44
1. Определение размеров клеток в делент~х окуларной линейки
осуществляют с помощью окулярной линейки (окуляр-микрометра),
которую помещают на диафрагму окуляра, для чего вывинчивают глаз ную линзу окуляра, устанавливают окуляр-микрометр и вновь завинчи вают линзу (рис. 18).
На столик микроскопа помещают препарат «раздавденная капля»,
препарат парафинируют для предохранения от высыхания нанесением расплавленного парафина на края покровного с_текла. Фиксированньlе
препараты для определения размеров клеток нежелательны, так как
фиксация и окраска может изменить размеры клеток. Если клетки под
вижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспен
зии добавляют О, 1% водный раствор агар-агара.
После установки препарата на столи ке микроскопа, проводят фокусировку объекта. Путем передвижения предметно
|
го столика в двух плоскостях располагают |
|
клетки на шкале окуляр-микрометра и |
IФIФIФIФIФ/•1 |
определяют, скольким делениям линейки |
|
соответствует длина и ширина клетки при |
|
данном увеличении микроскопа. Чтобы |
|
результаты были достоверными, измеряют |
|
обычно не менее 10-20 клеток. У кокков |
Рис. 18. Окулярный |
измеряют диаметр, у других форм - длину |
и ширину. |
|
микрометр |
2. Определение цены деления оку- |
|
лярной линейки в мкм проводят с помо |
щью объективной линейки (объект-микрометра) для данного увеличе
ния микроскопа.
Объективный микрометр представляет собой металлическую пла
стинку с отверстием в центре, в которое вставлено cтel(JIO. На стекло
нанесена линейка длиной 1 мм, которая разделена на 100 частей, так что
одно деление ее соответствует 0,0 l мм или l О мкм (рис. 19).
Для определения цены деления окулярной линейки на столик мик роскопа вместо препарата помещают объективный микрометр и при ма лом увеличении фокусируют изображение линейки. Затем перемещают линейку объект-микрометра в центр поля зрения и меняют объектив на
тот, при котором измеряли размер клеток. Перемещая столик микроско па и поворачивая окуляр, устанавливают микрометры так, чтобы их
шкалы были параллельны и одна перекрывала другую (рис. 20). Совме-
46
3. Расчет размеров'l(Jleтoк в мкм. Зная, скольким делениям окуляр
ноi! линейки соответствует длина и ширина изучаемого объекта, умно
жают цену деления окуляр-микрометра на эти числа:
N=N 1·a,
где N - длина иnи ширина клетки, мкм; N1 - чисnо -делений окуляр
ми1<рометра; а - цена делеНЮI окуляр-микрометра.
Размеры клеток микроорганюмов в К()Нечном счете записывают по
форме:
где N и N; - минимальное и максимальное значения длины клеткв, п и
п1 - минимальное и максимальное значение ширяиы клетки; мкм - еди
ница измерения размеров клеток, например: (2-3}·(0,l-l,0}.
·Результаты определения размеров клеток микроорганизмов вносят
в таблицу:
Результаты определения размеров клеток
Культура |
Число |
Длина |
1llирина |
Размер кле- |
||
изме- |
в делениях |
|
в делениях |
|
ток, записан- |
|
микроор- |
|
|
||||
ряемых |
окулярной |
|
окулярной |
|
ный по форме |
|
rаниз,ма |
вмкм |
ВМКМ |
||||
клеток |
линейки |
|
линейки |
|
(N-Ni) (n-n1) |
|
|
|
|
||||
Задание
1.Определить размеры клеток дрожжей Saccharomycescerevisiaeили гриба Endomycesmagnusii. препарат «раздавленной капли» (запа рафиненный). Объ~ктив 40х, либо lООх, МИ (масляная иммерсия).
2.Определить размеры бактерий Azotobacter chrooooccum.Препарат фиксированных клеток. Объект'!в lООх, МИ.
Работа 8. Окраска клеток по Граму
Для дифференциации микробных клеток, различающихся химиче
ским составом и структурой клеточных стенок, используется сложный
метод окраски - окраска по Граму (по имени датского ученого).
llpи окраске по Граму все бактерии делятся на две rруппы: rрампо-
ложктельные и rрамотрицатель11Ь1е. |
_ |
У грамположительных бактерий. (Г+) толщина _l(Jlеточной стенки
составляет 15-80 нм, состоит из пептидогликана (от 60-90%), располо
женных в несколько слоев белка (около 1%) и лиnидов (около 1%).Об
наружены полимеры особого типа - тейхоевые кислоты, ковалентно
47
связанные с пеmидоrликаном. Большое содер_жание пептидоrликана
обеспечивает при окраске по Граму образова1:1ие комrmекса с rенuиано вым фиолетовым и йодом, устойчивого к спирrу, вследствие чеrо они окрашены в сине-фиолетовый цвет.
Толщина кл~ноА С'l'енки грамотр,щательных бактерий 10-15 нм,
но структур.а ее значительно сложнее, чем у rрамположительных бак
терий. Основу ее составляют ориентироващп,~е внутренние липиды (10-20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки
мозаично расположены белки и полисахариды. Пептидогликан пред
ставлеw одним слоем толщиной всеrо 2-3 нм (около 5-10%), лежит под
:Липополисахарищщм слоем и плотно покрывает- протоrmаст. Из-за
большого содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных
бактерий при окраске по·Граму образует с генциановым фиолетовым и
йодом комrmекс, разрушаемый при обработке спиртом, вследствие чего клетки обесцвечиваются.
Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму
связано с различиями в структуре и химическом составе клеточwой
стенки бактерий.
К грамположительным микроорганизмам относятся кокки, бацил- - лы (спорообразующие палочки), актиномицеты, микобактерии, клост
.:~ ридиальные бактерии, дрожжи.
·-- К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии (не-
спорообразующие палочки), спириллы, сальмонеллы, E.coJi,псевдомо
нады, азотбактер, вибрионы.
Имеются грамвариабельные ~икроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняется на определенных этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, мя окраски по Граму используют клетки молодой куль,у ры, чаще всего односуточной. Для сравнения одновременно с опреде ляемым объектом целесообразно окрашивать клетки микроорганизмов,
•· отношение которых к окраске по Граму известно (контроль).
Окраску по Граму осуществляют \:Ледующим образом:
1. Готовят на предметном·стехле три мазка культуры микроорга
мов: в центре - мазок исследуемой культуры, слева и с.права - мазки
иrрольн.ых микроорmнвэмов(рffс. 21).
Мазки дqлжны б~ть тонкимi чтобы клетки равномерно были рас делены по поверхности сте.кла и не образовывали скоплений, так как
толщины мазка мoryr ~ависеть результаты окрашивания.
48
+
Рис. 21. Расположение мазков на предметном стекле при окраске по Граму
Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.
2.Окрашивают мазки карболовым rенциановым фиолетовым. На
мазки наносят достаточное колицество красителя, выдерживают 1-2 мин, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором
Люголя до почернения (приблизительно 1-2 мин).
3.Сливают раствор Люrоля и обрабатывают препарат 0,5-1 мин (строго!) 96% этиловым спиртом или путем погружения в стаканчик со
спиртом, или путем нанесения спирта на мазки (от времени обработки
мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточ
ной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной -
обесцвечиваются). ,
4.Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 мин
водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, вы сушивают фильтровальной бумагой.
5.Микроскопируют препарат с иммерсионной системой. Грампо ложительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, гра мотрицательные - в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополни тельного красителя).
Задание
Провести окраску по Граму бактерий Вacillus subtilis, ~seudomonas aeruginosa, Micrococcus lactis, Proteus vulgaris (по указанию преподава теля), используя в качестве контроля грамотрицательные бактерии Escherichia coli и грамположительные бактерии Sarcina flava.
Работа 9. Экспресс-метод определения грам-типа
микроорганизмов (по Крегенсену)
Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бакте
рий в щелочной среде и определении свободной ДНК.
На предметное стекло наносят каплю 3 %-ноrо раствора КОН, в
которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (l4-часо вая культура со скошенного arapa) и хорошо перемешивают петлей.
50
2. Окрашивают карболовым фуксином Циля ripи одновременном осторожном нагревании в течение 2-3 мин. Для этого предметное стек ло с одного конца берут пинцетом и нагревают над пламенем горелки
до появления паров (но не до кипения). По мере испарения красителя необходимо доливать его по каплям, не допуская подсыхания. Промы вают препарат водой. Микробные клетки остаются окрашенными в
красный цвет.
3. Обесцвечивают препарат 1 %-ным раствором серной кислоты в течение 10-15 с, немедленно промывают препарат водой (споры остают ся окрашенными в красный цвет, а микробные клетки обесцвечиваются).
4. Дополнительно окрашивают препарат метиленовым синим около
20 мин. Промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.
При правильном окрашивании микробные клетки должны быть синими,
споры красными, фон - бесцветный.
Задание
Провести окраску спор бактерий ·Bacillus .subtilis, В. suЬtilis var.
mesentericus, Вacillus mycoides (по выбору); аскоспор дрожжей Sac-
charomyces cerevisiae по методу Циля. Промикроскопировать, объектив 1ООх, МИ, зарисовать.
Работа 11. Окраска капсул
На клеточных стенках многих бактерий наслаиваются снаружи раз ной толщ1щы слои материала в большинстве случаев lfз полисахаридов с
высоким1 содержанием воды - это капсулы и слизь. Капсулы имеют упо
рядоченное фибриллярное строение с расположени~м фибрилл вдоль
клеточной стенки или перпендикулярно к ней.
В зависимости от толшины и строения различают микро-, макро
капсулы и слизистые чехлы. Капсулы и слюн не имеют жизненно важ
ного значения для ба!(Терии, но присутствие капсул часто обеспечивает более высокую степень их· выживания при неблагоприятных условиях,
большую резистентность к некоторым патогенным бактериям и фагоци
тозу, повышает их вирулентность.
Наличие капсул у микроорганизмов является непостоянным при знаком. Образование капсул зависит от условий внешней среды, состава
питательной среды, возраста культуры и др.
Капсулы имеют консистенцию гедя и плохо видны при микро
скопировании. Для выявления капсул применяют негативные методы
окраски.
51
Окраска капсул по методу Омелянского
Наносят каплю карболового фуксина·Циля и каплю воды на пред
метное. стекло. Помещают в каплю красителя исследуемую культуру
бактерий и выдерживают 2-3 мин. Добавляют кашпо жидкой черной
туши или 10 %-ного водного раствора нитрозина и тщательно переме
шивают. Накрывают покровным стеклом и просматривают с объекти вом 40х либо размазывают суспензию по стеклу, высушивают на возду
хе и микроскопируют с иммерсией.
Красиrели не проникают в капсулу, поэтому бесцветная капсула хорошо видна на общем темном фоне препарата и окрашенных в крас
ный цвет клеток бактерий.
Задание
Провести окраску капсул Azotobacterchroococcum.Промикроско пировать. Объектив 40х и 1ООх, МИ. Зарн:совать.
Работа 12. Окраска внутрмnлаэматических вкn~очений ·
В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в цитоплазме кле
ток_моrут формироваться морфологические образования, представляю щие либо продукты обмена клетки, либо запасные питательные вещест
ва. Включения различны по своей химической природе. Это моrут быть
жироподобные веществ~ полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза),
серополифосфаты (волщтин), кристаллы щавелевой кислоты ·и др. Они
не являются постоянными компонентами клетки, они образуются в зави
симости от условий культивирования, возраста культуры и могут ис
пользоваться в метаболизме клетки.
Клеточные вхлючения моrут выявляться цитохимическими мето
дами.
Окраска полисахаридов (rлиногена и rранулезы)
l. На предметное стекло наносят небольшую каплю микробной
суспензии, добавляют каплю конце!Щ)ирОванноrо раствора Люrоля и
выдерживают 10-15 мин при комнатной температуре.
2. Накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с сухой системой либо с иммерсией.
Гранулы крахмалоnодобных веществ (гранулеза) окрашены в си ний, а гранулы rликогеноподобных веществ (крахмал) - в красновато
коричневый цвет.
Окрашивание гликогена происходит в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорга-