Микра_Практ

14

центрирование кольцевой диафрагмы по оnюmению к фазовой пла­

стинке объектива.

Рис. 5. Схема хода лучей при

использовании фазово­

контрастноrо устройства:

1 - кольцевая диафрагма, 2 - конден­

сор, 3 - объект, 4 - обьектив, 5 - фа­

зовая мостина

Микроскопии в темном поле. МикросХОПЮI в темном поле ~ вана на освещении объекта косыми лучами света. Эти лучи не попадают

в объектив, поэтому поле зрения выr~ темным, Если препарат со­

держИ't' клmи МИКJ)ООРПЩИЗМОВ~·.ТО косые../JУ'Щ .QP(IXOM Чtpil'J,ТЦQЙ препарат, в значител"ноli степени отражаются от поверхности uсто.а: и

настолько уклоняются от своего первоначального направлени,~, чrо по­

падают в объектив. Тогда наблюдатель видит на черном фоне интенсив-

но светящиеся объекты, даже если их диаметр в 10раз меньше, чем.пре­ дел разрешения объеnива. Такое освещение препарата достиrаетс11.- менением специа,льноrо IСОндеисора. Темнопольиый конденсор ,им~ .

затемненную среднюю часть, поэтому центральные лучи света, IЩ)'Щ!JI.

от· зерща,. задер>J~, а в плоскость препарата попадают ~-

боковые лучи. 01ражеИIU,1е от зерхал"ных поверхностей, ~поло~ .•/

внуrри конденсора (рж:. 6); .. · . · ~ , ,При мижроскоnироеаиии в темном поле можно увидm. ~.

величина которых измеряется сотыми долями михрометра, т..е. ~ эа

пределами видимости обычного МИ1СрОСКопа. Однако наблюдение объеl:-

16

жевый окрашивает в зеленый цвет протоплазму, в розовый - вакуоли, в ярко-красный - метахроматиновые зерна и в светло-зеленый цвет - ядро.

Малая токсичность применяемых растворов красителей позволяет изу­

чать живую неповрежденную клетку. Такая юtведенная или вторичная

люминесценция имеет большое значение при проведении циrолоrnче­

ских исследований.

Электронная микроскопия. Электронные м~кроскопы применяют для изучения объектов и структур, находящихся за пределами видимости

обычных микроскопов. Разрешающая способность электронных микро­

скопов 1-40 А, увеличение в среднем 105 раз..Устройство электронного

микроскопа в принципе аналогично светооmическому микроскопу, от­

дельные узлы электронного микроскопа сходны с узлами обычного све­

тового микроскопа, перевернутого окуляром вниз, но роль световых лу­

чей в электронном микроскопе играет пучок электронов, излучаемых

специальным источником - электронной пушкой (рис. 7). Электроны

попадают в магнитную конденсорную линзу. Использовать стеклянные

линзы или зеркала для фокусировки электронов нельзя, так как стекло непроницаемо для электронов. В электронном микроскопе роль линз

выполняет круговое магнитное поле, под действием которого электроны могут. отклоняться или центрироваться. Функция конденсорной ЛlftnЫ

электронного микроскопа.аналогична выполняемой конденсором обыч• ного микроскопа - сведение пучка электронов в одной точке на объекте; Пройдя через объект, электроны попадают в объектную линзу, которая вновь фокусирует расходящийся пучок и дает первое промежуточное изображение объекта. Магнитный проектор (проекционная линза, анало­ гичная по .функции линзе окуляра) дает окончательное увеличсщие изо­ бражения объекта на флуоресцирующем зкране - металлической •пла- , . стинке, покрытой тонким слоем сернистого цинка или минерала, вwше-, , мита. При попадании на экран электронных лучей каждая часТ!Щll ЭТQГО слоя начинает светиться; замещая экран фотографической пластинкой, изображение. объекта можно сфотографировать.

Препараты для электронно-микроскопических исследований по­

мещают на специальные сетки, на которые нанесена тончайшая целлю­

лозная или пластмассовая пленка (подложка); общая толщина препарата

и подложки не должна превышать 2500 А. Для увеличения контрастно­

сти объекта проводят ero напыление тяжелыми металлами (хромом, золотом, палладием) в виде паров или проводят обработку контрасти­ рующими веществами (фосфорно-вольфрамовая кислота, уранилаце­ тат). При исследовании морфологических особенностей клеток микро­

организмов под электронным микроскопом изучают целые клетки;

19

этим ВИНТ()М надо очень осторожно, посколысу в микроскопе «LaЬoval-2» мажро- и микрофокусировки совмещены. Диапазон перемещения грубой наводки составляет 20 мм, что соответствует 4,5 оборота макромикро­

вmпа. Механизм точной наводки можно привести в действие в любом

положении грубой наводки с помощью изменения направления враще­

ния того же винта.

-,На предметном столике имеется обьектоводиrель для предметного

стекла 8. С помощью висящих коаксиальных кнопок. расположенных

слева под предметным столиком, осуществляется перемещение объек­ товодителя в продольном и поперечном направлениях. Ридом с макро­

микровиигом расположен винт конденсора 9, обеспечивающий его рас­

положение на нужной высоте.

В микроскопе «Laboval-2))имеются объективы, дающие увеличе­ ние в 3,2, 1О и 40 раз, предназначенные для работы с сухими системами, и объектив с черной полосой для иммерсионной системы, дающей -

увеличение в 100раз.

При работе с иммерсионным объективом, после установки света, при малом увеличении выбирают участок на препарате, на выбранное

место наносят каплю кедрового масла и осторожно погружают в нее

фронтальную линзу объектива I00x. По окончании работы остатки мас­

ла с этой линзы удаляют, тщательно протирая ее мягкой тканью. Осветительный аппарат находится под предметным столиком и

включает (см. рис. 8):

источник света в виде мкньона. Данная лампочка вмонтирована

внутри подставки, ее яркость можно регулировать при помощи

реостата 10,расположенного на задней панели, там же расположен

тумблер включения микроскопа в сеть; конденсор Аббе 11; апертуру конденсора можно регулировать, от­

крывая и закрывая диафрагму конденсора при помощи рычажка 12.

Конденсор Аббе состоит из двух линз, заключенных в металличе­ скую оправу и предназначенных для собирания лучей света, иду­

щих от зеркала;

отражающее зеркало, которое можно увидеть в окошко 1З. Коли­

чество лучей, попадающее на зеркало, можно регулировать при

помощи диафрагмы светового поля. Ры-тхсок диафрагмы обозна­

чен позицией 14.

Установка света по Келеру. -Наилучшие результаты при работе с

микроскопом могут быть получены лишь при условии правильного ос-

21

культур или при извлечении части клеток для приготовления препарата

необходимо строго соблюдать условия, которые позволили бы предо­

храниrь культуру ОТ заrрJ1ЗНеНИJ1 другими микроорrаUИЗМ&МИ. 8 про­

цессе приготовления фиксированного препарата можно выделить три

этапа: 1)приготовление мазка, 2) фиксация, 3) окраска пре~.

Приготовление мазка. Пробирку с чистой культурой берут в ле­

вую руку таким образом, чтобы была хорошо видна поверхность пита­

тельной среды с выросшей на ней культурой. В правую руку берут бак­

териологическую петлю так, как держат карандаш, и прокаливают ее в

пламени горелки. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают ватную пробку к ладони и держат так во время последующих манипуляций. Края открытой пробирки обжи­ гают в пламени горелки, вводят в нее петлю и берут небольшое количе­ ство микробной массы. Горлышко пробирки снова обжигают, слегка обжигают пробку и закрывают ею пробирку, а микробную массу пере­

носят в каплю воды на обезжиренном предметном сте1t11е. Не следует

вносить много культуры, капля должна стать слеrка муrиой. Осrаток

микробной массы на петле сразу же сжигают в rшамени горелки. Из

капли с внесенной культурой готовят мазок, равномерно размазывая ее

петлей или краем покровного стекла на площади 2-4 см:2• Мазок просу­

шивают на воздухе или слегка нагревая в струе теrшовоrо воз;ll)'Ха вы­

соко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Нельзя пере­ гревать мазок: клетки микроорганизмов могут деформироваться! Хоро­

ший мазок после сушки должен давать на предметном стекле еле замет-

Фиксация препарата. После высушивания приступают к фикса­ ции препарата. Фиксация имеет целью: \) убить микроорганизмы, 2) обеспечить их лучшее прилипание к стеклу и, тем самым, предохранить

препарат от смьmания, 3) сделать мазок более восприимчивым к окра­

ске, так как мертвые клетки лучше красятся, чем живые.

Для фиксации чаще всего используется высокая температура. С этой

целью захватывают предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза

проводят через пламя горелки. Перед окраской препарат охлаждают(!). Для исследования тонкого строения клетки применяют фиксацию

различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость нано­ сят на мазок, или препарат погружают в фиксаТQр. При фиксацн11 этило­ вым спиртом время фиксации 15-20мин, метиловым спиртом - 3-5 мин,

ацетоном - S мин. По окончании фиксации препарат осторожно промы­

вают водопроводной водой.