Микра_Практ
.pdf
119
Цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят к бес
цв1;,-тнъ1м) или пигментированная - белм, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная. Особо отмечают выделение пигмента в суб страт. При описании колоний актиномицетов отмечают пигментацию воз душного и субстратного мицелия, а также выделение пигментов в среду.
Консистенцию коло1-1~щ определяют, прикасаясь к ее поверхности
петлей. Колония может легко сниматься с arapa,быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (приmmает к петле), тяrучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей).
При изучении морфологии клеток в световом микроскопе (бакте
-рии - на фихсированных -npenapaЩ, объективы с маСЛJ1ной иммерсией;
грибы, дрожжи, водоросли,-простейi.uие - на npenapaтe раздавленная
капля) определяется не то11~ко форма клеток, ио их взаимное располо
жение, нanpttмep, .в виде цепочек, неравищсериых tкоплений tt т. п.
Qrмечаются также специфические морфолоrические признаки, ес
ли они имеются, например, наличие эндоспор, эюоспор, капсул, цист,
плодовых тел, пли такие свойства, как с1<ользящая подвижность, истин
ное ветвленне и способность к размножению почкованием.
Необходимо использовать окраску по Граму. как обязательный ме
тод для первичного изучения выделенных штаммов бактерий.-
3.3.Характеристп1Са чистой культуры
3.3.1.Обыч~о колонии из меток чистой культуры, высеянно~ на
плотную среду, похожи одна на другую, что и служит дQJ<азательством
чистоты ку11ьrур~ (но есть и исюnочения. напр~ер, в случае rоiссоциа~ щ,и колонийна.гладкие (S) й СКJiадчатые (R). .
Глубинные колонии довdльно однообразны. Чаще всего они no ви•
ду похожи на более или менее сплющенные чечевички, в проекции
имеющие форм)"-овалов с заостренными концами. Лишь у немногих
бактерий тлубннные колонии напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний час
то сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы вы
дешпот ут,1екислоту или другие газы.
Донные колонии разных мmсроорганизмов имеют обычно вид тон
ких прозрачных пленок, стелющихся no дну.
Размеры и другие особе~rности колонии мoryr изменяться с возрас том и завис,~,т от состава среды. Позтому при их описании указывают возраст культуры, состав .cpeJU,Jи температуру кул1.тивирования.
3.3.2. Гq,и опксании,РQСТа ми~роорrанизмов по шrриху отмечают
следующие особенности: скудный, умеренный или обильный, сплошной
120
с ровным или волнистым краем, четковидный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный• или ри зоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверх
ность и консистенцию.
Дпя оnисания колоний и роста по штриху многне микроорганизмы
часто выращивают на мясо-пептонном arape.
3.3.3. Другой критерий чистоты культуры - это морфология кле
ток. Для чистой культуры обычно характерна высокая степень ~орфо
логического сходства клеток в окрашенных и влажНЬJХ препаратах. Од
нако бывают исключения, в зависимости от возраста культуры, исполь
зуемой среды или других условий роста. Возможно образование кокко: видных форм, цист и спор, а также проявление плеоморфизм.
3.4. Изучение физиологии микроорганизмов
На первых этапах выделения чистой культуры устанавливается,
является ли организм фототрофным, хемоавтотрофным или хемогетеро
трофным.
3.4.1. Определение способности микроорганизмов использовать
углеводы и сахара-спирты.
Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью
использовать различные соединения углерода дЛЯ конструктивного и
энергетического обмена, Дпя идентификации большинства гетеротроф ных микроорганизмов необходимо определить, какие углеродсодержа щие вещества обеспечивают рост данного организма и какими измене
ниями среды сопровождается его рост.
Как правило, испоiьзуют следующие углеводы: арабинозу, ксило зу, глюкозу, фруктозу, галактозу, сахарозу, лактозу, мальтозу и спирты
- глицерин и маннит.
Готовят среду основного состава на водопроводной воде (r/л): пеп-
тон - 5,0; К2НРО4 - l ,O. .
Среду разливают в пробирки 'по 9 мл в каждую и стерилизуют nри l атм. Углеводы и спирты рекомендуется с:rерилизовать отдельно в виде
lО %-ных водных растворов и добавлять после стерилизации tc стериль
ной среде в количестве 1%. Растворы дисахаридов лучше стерилизовать
фильтрованием, чтобы избежать их mдролиза при высокой темirературе.
Среды углеводами и спиртами засевают одновременно 0,1-0,2 мл
суспензии клеток изучаемого мИIСрОорrанизма и стаuт в термостат. Ес
ли организм развивается быстро, то резулътатьr можно регистрировать
через 48-96 часов, а если медЛенно - через 7...1,О суток.
Визуально по помуmению среды, образованию плеНl(И, осадка от мечают рост или ero отсутствие на всех использованных средах. Рост на
121
средах с этими соединениями может приводить к накоплению органи
ческих кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот отмечают по измененцю рН среды; образование газов - по появлению
на поверхности среды пены. Чтобы обнаружить изменение_ рН, к среде
добавляют индикатор - броldтимолблау, из расче1'8 2 мл 4,6 %-ноrо спиртового раствора на I л среды. При рН 6,0 индикатор желrого, а при рН 7,6 синего цвета.
Результаты сравнивают с контрольной средой, не содержащей ни
углеводов, ни спиртов.
На основании полученных результатов делают заключение о том,
какие углеводы и спирты использует изучаемый организм,
Чтобы исключить необходимость инокулировать большое количе ство разлитых по пробиркам сред, в настоящее время разработаны и имеются в продаже разнообразные наборы для удобного и быстрого
проведения данных тестов. Подобные системы идентификации приве дены в работе (5).
3.4.2. По отношению к кислороду микроорганизмы делят на четыре
большие группы:
1.облигатные аэробы;
2.микроаэрофилы;
3.факультативные анаэробы (аэробы);
4.облигатные анаэробы.
Для описания микроорганизмов и дальнейшей идентификации на блюдают рост изучаемого организма после посева уколом в агаризован
ную среду или после посева в расплавленную аrаризованную среду.
Строгие аэробы растут на поверхности среды и в самом ·верхнем ее
слое, микроаэрофилы - на некотором расстоянии от·по~ерхности среды,
факультативные анаэробы - |
по всей толще среды, облигатные ~наэробы |
- только в глубине среды. |
· |
Благоприятную для роста микроорганизма среду (например, МПА) раз,11ивают в чеrыре пробирки на 1/2, ее 11wсоты и стерилизуют при I атм. В две пробирки с МПА посев .проводЯт у~олом. МПА в двух.других про бирках расплавляют в кипящей водяной бане, охдаждают до 45-50° С, а затем в среду добавляют водную С.)'СПензИJQ клеток исследуемого орга
низма, тщательно перемешивают и дают arapy застыть.
Отмечают рост и его интенсивность по уколу и в толще среды и,
соответственно, характеризуют отношение организма к кислороду.
123
чает положительную реакцию. Можно добавить несколько капель 3 %-ной перекиси водорода к колониям на чашке. В случае бульонной культуры к 1 мл культуры .Д(Ю8ВJUIЮТ I мл 3 ~ной пере!iИСи водорода и наблюдают
за постоянным образоааннем пузырьков. Чтобы усwанип. проблему впи тывания, которая может возникать при добавлении перекиси водорода в
колонии, вwpocUJ)'IO кyJtъ-rypy сннмаюr с поверхности arapaнеме'1'81111ЯЧе
ским инструменfuм и сусnеидируют в Ш1Ле 3 ~ной .r~ерекщ:н iiодор!)да
на предме1'НОМ стекле: Немедленно и через 5 минуr иаблюдают за обраэо
ванием пузырьков визуально или в мщqюсl{оп с малым уве11ИЧением.
Однако следует помннть,-что тесты на каталазу и оксидазу не дают
хорошей воспроизводимости результатов.
3.4.4 ..Если известны особые физиоло,.>ические свойства, присущие микроорганизму, то это облегчает его идентификацию. Например:
1. спо.собность к азотфиксации;
2, ферментативная активность;
3.образование аммиака;
4.образование сероводорода;
5.восстановление нитратов;
6.способность микроорганизма образовывать пигмент, красящие ве щества, что свойственно многим бактериям, особенно обитателям
почвы и воды и грибам. Колонии пигментообразующих микробов
окрашиваются в разнообразные цвета: белый, желтый, красный, розовый, черный, зеленый и др. Если пигмент растворим в воде, то
питательная среда, в которой растут пиrментообразующие бакте
рии, также окрашивается в соответствующий цвет. Но у некоторых бактерий пигмент остается связанным с клетками. Наиболее актив
но пиrментообразование происходИт при комнатной ~мпературе,
хорошем доступе.кислорода и света;
7.чущ:твительность куль-rуры ас антибиотикам и способность проду цировm, аиt'ИVИОТИКИ (таблица 4).
3.5. Иwн!Аеванitе дииамнJСИ ·fOC1'8{nостроеиие крквой роста)
микроорf141Ц1Зма на -глюкозе иаи .цруrом углеродном с:убс:трате в эави~
симости отфизиологических ~~йскут.туры. |
/ |
3.6. Таксономия и к.ласек♦и•IUf• микроорnанJUмоа |
, |
Таксонамией иазываеюя иауаа о 1СЛассифlfКаlUIН микроорпuщзмов.
Группу орrанизмов, oбJl8д8IOIWIX эадаикой степенью однородности,
назыJi11ОТ таксоном. |
, |
Отношение между группами организмов (таксонами) изучает сис
тематика. -
124
В соответствии с действующим кодексом номенклатуры бактерий приняты следующие классификационные категории щ~рства прокариотов:
отдел ~ класс - порядок - семейство - род - вид.
Вид является основ,юй таксономической единицей.
Табл11ца 4. Наиболее широко применяемые антибиотики
|
Анти- |
Основной |
Объект во:щействия |
Механизм действия |
|
биотик |
nродуцент |
||
|
|
|
||
|
Пеницил- |
Penicilliшn |
Грамположительные |
Подавляет образование |
|
лин |
chrysogenum |
бактерии |
клеточной стенки |
|
Цефалосп |
Cepha\ospo- |
Грамположительные |
Тоже |
|
орин |
rium sp. |
и грамотрицательные |
|
|
|
|
бактерии |
|
|
Стрепто- |
Streptomy- |
Грамположительные |
Подавляет фующии |
|
миuин |
ces griseus |
и грамотрицательные |
рибосомальных·5os |
|
||||
|
||||
|
|
|
бактерии |
субъединиц |
|
|
|
||
|
Эритро- |
S.erythreus |
Грамположительные |
Тоже |
|
||||
|
миuин |
|
бактери_и |
|
|
|
|
||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Тетра- |
S.aureofa- |
Грамположительные |
Ингибирует связыва- |
|
циклин |
cieпs |
и грамотрицательные |
ние аминоацил-тРНК |
|
|
|
бактерии |
с рибосомой |
|
Полимик- |
Bacillus ро- |
Грамотрицательные |
Разрушает цито- |
|
син |
lymyxa |
бактерии |
плазматическую мем- |
|
||||
|
|
|
|
брану |
|
Бацитра- |
B.subtilis |
Гр·амположительные |
Подавляет синтез ком- |
|
ЦИН |
|
бактерии |
понента клеточной |
|
|
|
|
стенки пептидоrликина |
|
Амфоте- |
. Streptomy- |
Микроскопические |
Действует на комnо- |
|
рицин В |
ces nodesus |
грибы |
неmы мембран |
|
||||
|
Хлорам- |
S.venezuelae' |
Грамположительные |
Подавляет процесс |
|
||||
|
феникол |
|
и грамотрицательные |
tранстщии в рибосо- |
|
|
|
бактерии;·риккетсии |
мах |
Дщ1 микроорrаннзмов, так же как и для животных и растений, при
нята бинарная система номенклатуры, т. е. указывается родовое и вило
вое название. Например: Bacillus (род) subti!is (вид).
В микробиологии используются также такие понятия как штамм и
клон, не относящиеся к таксономическим категориям.
125
Штамм - это культура, выделенная из определенного местообитания.
Клон - совокупность осо()ей микроорганизмов, происходящих из
ОДНОЙ КЛСТКИ.
Одной из задач таксономии является полное сшисание и Идентифи
кация основных таксономических ециниЦ; видов, т. е. определение к ка
ким таксонам относится организм.
Таксономические категории микроорганизмов описываются с ПО"
· мощью таких признаков:
морфологические;
цитологические (основные органеллы, строение клетки);
-культуральные (характер роста на определенных средах);
физиолоrо-биохимические;
-иммунологические.
Для идентификации бактерий помимо этих признаков изучается и
ряд других молекулярно-биологических: определение нуклеотидного
состава, последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК, последова
тельность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функ
циями идр.
Используетси также метод гибридизации ДНК, что позволяет оп ределить степень rомолоrичности ДНК организмов (6).
Новейший способ идентификации бактерий - это применение ге нетических зондов. Метод основан на определении специфического
участка молекулы ДНК данного организма. Зонд представляет собой
небольшой отрезок ДНК, нуклеотидная последовательность которого уникальна для данного вида или рода бактерий. В целях идентификации
исследуют реакцию меченного флуоресцентным красителем, радиоизо
топом или биотином зонда с денатурированной молекулой ДНК иссле дуемого организма. Если ДНК организма содержит комплиментарную зонцу последовательность, произойдет ее связывание с ДНК зонда за
счет·спариванwi комплиментарных оснований.
К настоящему времени имеются флуоресцентные зонды к генам рибосомных РНК, позволяющие проводить определение живых микро-,
орrанизмов под микроскопом. |
' |
Однако, ·пока не создана систематика микроорганизмов, |
которая |
учитывала бы их физиологические. особенности, данные их генетиче
скоrо анализа и фнлоrенетики, т: е. родственных отношений между
прокариотами и историю их эволюционного развития. ·
Микроорганизмы в настоящее время не столько систематизирова
ны, сколько каталогизированы. Основная цель составления каталога практическая - осуществить быструю идентификацию микроорганизмов.
126
В соответ<:твии с определителем бахтерий призкаки, ·по которым осуществляется разделение бактерий на группы, )lenro определяемы и вынесены в название группы. Например, rpyпna 7 - «Грамотрицатель
ные палочки " кокки аэробные» (7).
Идентификация пмучениоЯ чис,-ой культуры· не яВJJЯется основ~
ной задачей самостоятельной работы, посколъtсу это "lребует продопжи
телыJоrо времени для выполнения и разнообразных ма~иалоп, кото
рыми в полной мере кафедра не располагает.
Однако при выполнении самостоятельной работы ·студент может
исследовать р,~д важных для идентификации культуры свойств, что мо жет быть использовано ш~я первичной оценки принадлежности микроор
ганизмов к определенно/! группе, семейству или роду. В частности, мор
фологические свойства, определение размеров клеток, тип окраски по
Граму, способность к аэробному или анаэробному катаболизму сахаров,
температурные rрвницы роста, чувствнтельJIОСТЬ к антибНОТЮ<аМ:
В ·лабораторных условиях студентами может быть·исследован ряд
других простых биохимических и физиологических тестов, которые необходимы для идентификации орrанизмов (раздел 3.4).
4. Предстаме11иерезультатов вътолненной работы
Результаты выполненной работы оформляются в виде отчета и
представляются по форме, соответствующей приНJ1той дпя научных от
четов, публикации результатов исследований в научных журналах. От
чет включает следующие разделы:
1. Введение, в котором обосновывается ак,уальность темы выпол
ненных исследований, формулируются основная цель работы и ее задачи.
2. Объекты и методы.·Описыliается основной объект исследова
ния. Перечисляются использованные в работе методы, включенные в
методические рекомендации к лабораrориым работам по микробиоло гии. Полробно описываются другие использованные мето,11Ы, приводит
ся ссьuпса на источник.
3. .Реэулыпапш ш:следовании и их о6суждеииг. ПриводятсА полу-.
ченные результаты в виде таблиц, рисунков и rрафIJков, которые обсу
ждаются по мере их представлеиия.
Наиболее простым способом представления .uннwх 1ВJ1J1етс11 со ставление тобл1щ. Таблица - первый mш perкcrpaцilИ научной инфор-
,,;:.
Графически данные могут быть представлены в виде линейного графика. Экспериментально полученные точки соединяются линиями: прямыми, плавной кривой или кривой регрессии. На каждой координат-
127
ной оси необходимо· отмечать название и размерНQСТI> переменной.
Шкалы должны быть разбиты на интервалы с равным количеством едн
ниц,.которые обо3начаюrс• цифрамирядом со шкалой.
. Если требуется крупный масштаб в области, начинающейся 11е от
нуц то после нум 1{а оси делается отметка о разрыве(-//-). |
· |
Метод оценки значений путем измеренЮI координат любой точки,
лежащей на линии, соединяющей экспериментально полученные точки,
называется и11терполяцией.
Метод определения координат крайних точек путем продолжения
линии графика дальше значения последней экспериментальной точки,
называется экстраполяцией.
Крутизну кривой можно оценить с помощью градиента - величи
ны, характеризующей скорость изменения переменной в каждой точке rрафика, Кроме линейного графика,дани~~ мoryr_быть представлены:
-диаграммой в виде вертикальных столбцов; диаграммой в виде горизонтальных столбцов; rистоrраммой;
-хайт-днаrраммой (8).
Полученные в научных экспериментах данные должны быть стати стически обработаны.
Оценка среднего зиачения может быть проведена на основании
арифметического среднего, медианы и мрды.
Оце11ка разброса величин или мера рассеяния включает дисперсию
и стандартное отклонение.
Статистическu обработка проводится дnя тоrо, чтобы определить
достоверна ли разница между двумя группами данных (8, 9).
Все рисуюrn; таблищ;J.и графики должны быть подписаны. На изо
бражениях, noлyчemпilx с помощью микрофотосымки, необходимо
ук_азать увеличение.
5.Выводы.
6. Список использованной дumературы.
Помимо отчета преподавателю пре.nставnяется чистая куль,ура мик
роорганизма, высе1111f8Я на еttошенной твердой среде, а та!(Же рассеянная
на чашке ПетрJJ; ипи .оруtой микробиолоrический материал, еооn~еrсt
вующий задачам исс:леJll)В8НИЙ.
Завершенная ·работа по усмотрению преподавателя может ·защи
щаться в виде доклада на занятиях_rруnпы.
Работа оценивается по балльной системе.
128
Приложение
Питательнь,е среды для культивированш, микроорганизмов
Мясная вода. Мясо освобождают от костей, жира, ПJrенок и сухо-
жилий, пропускают че~з мясорубку, заливают двухили четырехкрат
ным количеством водопроводной воды (по весу) и кипятят в течение часа. Жидкость фильтруют через вату или полотно, затем через фильт ровальRую бумагу; фильтрат измеряют и доливают до первоначального
объема дистиллированной водой.
Разливают по 3-5-литровым бутылям и стерилизуют при 120° С в течение 30-40 минут.
Мясо-пептонный бульон (МПБ). К мясной воде добавляют 1% пеп
тона, 0,5% химически чистой поваренной соли и 10% воды (на выкипа ние). Кипятят до растворения пептона, затем в еще горячем бульоне уста
навливают (насыщенным раствором едкого натра) рН 7,3-7,5. После до
бавления щелочи бульон еще раз кипятят в течение 15-20 минут и фильт руют через бумажный фильтр. Бульон разливают по пробиркам (колбам) и стерилизуют при 120° С в течение l 5-20 минут (после стерилизации рН, как правило, дает сдвиг на 0,2--0,3 в сторону кислой реакции.
Мясо-лептонный агар (МПА). На 1 л мясной воды берут 10 r пеп тона и 5 r поваренной соли, варят в течение 30 минут, устанавливают рН, фильтруют, добавляют 30 r лучших сортов архангельского arapa (одес ского нужно брать 60 r), нагревают до полного растворения и проверяют реакцию. Фильтруют через вату или марлю (в теплом автоклаве), а затем
прозрачную среду разливают по колбам и стерилизуют при 120° С в те чение 15-20 минут.
Дрожжевой автолизат используют для приготовления основного питательного субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов,
способствующих их самопереваривацию. Дрожжевые среды обесqечи
вают пышный рост, несмотря на низкое содержание общего азота и сла
бую степень его расщеплеиюr:
Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтоб1,1 автолизат занимал око
ло l/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей {18 ~{)-литровую бутыль). Бу тыль с дрожжами ставят на 2 суток в термостат при температуре около
60° С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равно
мерного прогревания содержимого ( 1-2 раза в сутки). Конец автолиза