12. Транскрипция у эукариот. Основные этапы транскрипции: инициация, элонгация, терминация. Регуляция транскрипции (в вопросе 10).

Транскрипция – это процесс синтеза РНК на матрице ДНК, происходящий во всех живых клетках. Этапы транскрипции: Инициация (узнавание ДНК-промотора и сборка РНК-полимеразы), элонгация (синтез пре-мРНК), терминация (остановка синтеза пре-мРНК, распад РНК-полимеразы).

РНК-полимераза синтезирует полинуклеотидную цепочку РНК из рибонуклеозидтрифосфатов, используя одну цепь ДНК в качестве матрицы (антисмысловая или некодирующая цепь). Клетки содержат несколько типов РНК: матричные РНК (мРНК), рибосомальные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК) и малые РНК. Транскрипция начинается с промоторной последовательности (промо́тора), с которой связывается РНК-полимераза. Синтез цепи происходит в направлении 5’→ 3’. Некоторые гены экспрессируются конститутивно (т.е. постоянно), остальные регулируются с помощьюбелков-регуляторов(ингибиторов или активаторов) и экспрессируются индуцибельно (при действии определенного стимула).

Эукариоты имеют три ядерные РНК-полимеразы,синтезирующие

разные типы РНК. Каждая полимераза узнаёт только строго определённые промоторы. Промоторы у эукариот разнообразны: они отличаются по своему расположению относительно сайта инициации транскрипции и могут состоять из разных последовательностей нуклеотидов.

К примеру, промоторы генов, кодирующих мРНК, содержат:

1.TATA-бокс:последовательность, богатая A·T парами и расположенная за25–31нуклеотид до сайта инициации транскрипции(–25–31).TATA бокс напоминает–10область прокариотического промотора (бокс Прибнова). Примерно у 2/3 генов TATA-боксотсутствует.

2.Inr-элемент:короткая последовательность из 7 нуклеотидов, содержащая инициирующий нуклеотид (+1).

3.CAAT-бокс:последовательность, расположенная между–70и–90нуклеотидами.

Такие промоторы узнаются РНК-полимеразойII. Промоторы других генов имеют иное строение.

Энхансеры исайленсеры — это участки цепи ДНК, представляющие собой сайты связывания регуляторных белков, функционирующих как активаторы или ингибиторы транскрипции, соответственно. Энхансеры узнаются специфическими транскрипционными факторами, помогающимиРНК-полимеразесвязаться с определённым промотором.

Рассмотрим инициацию транскрипции на примере РНК-полимеразыII. Транскрипция генов эукариот, считываемых РНК-полимеразойII, начинается со связывания TATA-связывающего белка (англ.TATA-bindingprotein, TBP) сTATA-боксом.

Затем к TBP присоединяются другие субъединицы и образуется фактор TFIID. После этого к комплексу промотора и TFIID присоединяются другие основные транскрипционные факторы (GTF, general transcription factors):TFIIA,TFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIH. Далее фактор TFIIF связывает РНК-полимеразуII (это похоже на связывание σ-субъединицы с РНК-полимеразой у прокариот). Фактор TFIIH разматывает двойную спираль, поскольку обладает хеликазной активностью. Формируется открытый комплекс. Происходит инициация синтеза РНК. Образуется короткая цепочка рибонуклеотидов.

Стоит отметить, что не все промоторы содержат TATA-бокс.В таких случаяхInr-элемента бывает достаточно, чтобы корректно ориентировать РНК-полимеразуна цепи ДНК. При этом присоединение TATA-связывающего белка происходит в области–30,хотяTATA-бокстам отсутствует.

В ходе инициации РНК-полимеразаII начала синтез РНК на матрице ДНК

и успешно образовала короткую цепочку рибонуклеотидов. Теперь транскрипционный аппарат переходит в элонгационную форму: происходит перемещение фактораTFIIB относительно комплекса, чтобы он не мешал выходу растущей цепи РНК, и фосфорилированиеC-терминального доменаРНК-полимеразы.На этой стадии происходит синтез цепи РНК.

Фосфорилированная РНК-полимераза,покидая промотор, «оставляет» позади несколько транскрипционных факторов, среди которых — TFIID. Последний может связывать другую молекулу РНК-полимеразыII и снова способствовать инициации синтеза РНК.

Входе элонгации к фосфорилированному С-терминальному доменуРНК-по-лимеразы присоединяется комплекс из 6 белков, который называется элонгатором. Его связывание с полимеразой необязательно, однако ускоряет процесс синтеза цепи РНК. Это было доказано экспериментами in vitro.

Вэлонгации также участвуют факторы TFIIS, называемые факторами, блоки-

рующими диссоциацию полимеразы (arrest release factors).

Уэукариот существуют консенсусные сайты терминации AAUAAA на РНК. Сама

терминация происходит так: покаРНК-полимераза синтезирует растущую цепь РНК, к самой цепи РНК могут присоединяться эндонуклеазы и разрывать связи внутри неё между нуклеотидами, способствуя отщеплению цепи РНК от полимеразы.

Первичные транскрипты мРНК (пре-мРНК) большинства эукариотических структурных генов модифицируются в ходе транскрипции: на5’-концедобавляется кэп (это происходит почти сразу после инициации),интроны вырезаются (в ходе элонгации), а на 3’- конце достраивается поли-(ААА)-хвост (уже после терминации).

А Кэпирование

Кэп представляет собой7-метилгуанозиновый(m7G) остаток, связанный с первым нуклеотидом транскрипта с помощью особой5’–5’-трифосфатнойсвязи. Кэп добавляется к транскрипту, когда его длина достигает ~30 нуклеотидов. Кэпирование происходит в несколько стадий:

1.Удаляется фосфатная группа с терминальной 5’-трифосфатнойгруппы мРНК с помощьюРНК-трифосфатазы.

2.Присоединяется остаток гуанозина с помощью кэпирующего фермента, использующего ГТФ в качестве источника энергии.

3.Гуанин метилируется ферментом гуанин-7-метилтрансферазой.До-

нором метильной группы служит S-аденозилметионин.

Кэпированные мРНК устойчивы к действию 5’-экзонуклеаз(ферменты, отщепляющие концевые нуклеотиды в цепях нуклеиновых кислот и, таким образом, защищающие клетки от чужеродных РНК), а значит, имеют бо́льший срок жизни в клетке.

Б Полиаденилирование

Эукариотические мРНК имеют поли(А)-хвосты — цепочки адениловых нуклеотидов длиной ~250 нуклеотидных остатков (~80 у дрожжей) на3’-концецепи. Присоединение хвоста происходит в две стадии:

1.Внутри транскрипта разрываются связи примерно через15-25нуклеотидов после цепочки нуклеотидов AAUAAA и за менее чем 50 нуклеотидов до участка богатого U- илиGU-нуклеотидами.

2.Поли(А)-хвостсинтезируется из АТФ ферментомполи(А)-полимера-

зой.

Как только эукариотическая мРНК попадает из ядра в цитозоль, к её поли(А)- хвосту присоединяется особый поли(А)-связывающий белок. Экспериментально было доказано, что синтезполи(А)-хвоста и связывание этого белка с ним стабилизирует мРНК и защищает её от действия клеточных нуклеаз.

В Сплайсинг

Большинство генов у высших эукариот содержат интроны (некодирующие участки), которые подвергаются сплайсингу после транскрипции, т.е. удаляются, а оставшиеся экзоны (кодирующие последовательности) сшиваются между собой. В этом процессе участвуют малые ядерные РНК в комплексе с белками (сплайсосома).

ГАльтернативный сплайсинг

Альтернативный сплайсинг — распространенный механизм, обеспечивающий многообразие белков. В пределах молекулы пре-мРНК может существовать несколько позиций для сплайсинга. Один участок может являться как интроном, так и экзоном. Активируют альтернативный сплайсинг особые транс-действующие факторы сплайсинга.

Альтернативный сплайсинг — один из факторов такого огромного разнообразия антител.

13. Посттранскрипционные модификации пре-мРНК (процессинг или созревание пре-мРНК) у прокариот и эукариот: кэпирование, полиаденилирование, сплайсинг пре-мРНК. Их роль.

Посттранскрипционные модификации - разнообразные изменения структуры первичных продуктов транскрипции (пре-РНК) до их выхода из ядра; посттранскрипционные модификации пре-мРНК включают сплайсинг, кэпирование, полиаденилирование.

(Процессинг = созревание мРнк, в ходе которого и происходят посттранскрипционные модификации пре-мРНК). У эукариот процессингу подвергаются все виды пре-РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК.

Посттранскрипционные модификации РНК особенно характерны для эукариот, у которых в силу мозаичной интрон-экзонной структуры их генов первичные транскрипты представлены гигантскими предшественниками, включающими в себя последовательности как экзонов, так и интронов (У ПРОКАРИОТ ИНТРОНОВ НЕТ!!!ПОЭТОМУ СПЛАЙСИНГ НЕ ПРОИСХОДИТ)

Кэпирование - происходит еще во время транскрипции. Процесс состоит в присоединении к 5'-трифосфату концевого нуклеотида пре-мРНК остатка гуанозина.

"Кэп" необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 5'-конца, а также для связывания мРНК с рибосомой и для начала трансляции.

Сплайсинг - Многие гены состоят из экзонов - кодирующие участки и интронов – некодирующие участки. При транскрипции с гена считывается РНК несущая как экзоны, так и интроны. В процессе сплайсинга интроны, с помощью сплайсосом, вырезаются, а экзоны сшиваясь образуют зрелую РНК.

Сплайсосому составляют пять малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП) и некоторое количество дополнительных белковых факторов. Содержащиеся в сплайсосоме мяРНП называются U1, U2, U4, U5 и U6. Главная сплайсосома принимает участие в сплайсинге интронов, содержащих гуанин и урацил (GU) в 5'-сайте, и аденин и гуанин (AG) в 3'-сплайсинг-сайте.

Полиаденилирование - Специальный фермент - poly(A)-полимераза, с использованием АТФ, присоединяет к 3'-концу каждого РНК-транскрипта, которому суждено стать молекулой мРНК, от 100 до 200 остатков адениловой кислоты, что завершает процесс образования первичного РНК-транскрипта. Поли(А)-хвост необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3'-конца.

Роль посттраскрипционных модификаций заключается в «активации» незрелых пре-мРНК и их превращение в мРНК.

14. Генетический код и его свойства.

Генетический код – это система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот, основанная на определённом чередовании последовательностей нуклеотидов в ДНК или РНК, образующих кодоны, соответствующие аминокислотам в белке.

Свойства:

Триплетность - триплет - наименьшая структурная единица генетического кода. Состоит она из трёх нуклеотидов (3 нукл=1аминк.). 20 аминокислот невозможно закодировать одним или двумя нуклеотидом т.к. последних всего 4. Три нуклеотида из четырёх дают 43 = 64 варианта, что с избытком перекрывает число имеющихся у живых организмах аминокислот.

Вырожденность или избыточность - аминокислоты могут кодироваться несколькими кодонами.

Однозначность - каждый триплет кодирует только одну аминокислоту. Таким образом, в направлении кодон – аминокислота генетический код однозначен, в направлении аминокислота – кодон – неоднозначен (вырожденный).

Полярность - считывание информации с ДНК и с иРНК происходит только в одном направлении.

Неперекрываемость - нуклеотид одного кодона не может быть одновременно нуклеотидом другого кодона.

Компактность - между кодонами нет знаков препинания.

Универсальность - код един для всех организмов, живущих на Земле.

15. Трансляция (биосинтез белка). Основные этапы трансляции: инициация, элонгация, терминация. Кодон и антикодон тРНК. Открытые и закрытые рамки считывания. Строение рибосомы эукариот и прокариот.

Трансля́ция - процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной РНК (иРНК, мРНК), осуществляемый рибосомой. (происходит на рибосоме в направлении 5^,-3^,).

Этапы:

Подготовительный этап – присоединение аминокислот к тРНК

1) Активация свободных аминокислот в цитоплазме (Ам.к+АТФ=Ам.к(акт.))

2) Аминоацетилирование тРНК (Ам.к(акт.)+тРНК=аминоцил-тРНК)

Инициация — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза.

Синтез белка начинается с присоединения малой субъединицы рибосомы к 5^, концу мРНК несущему стартовый кодон AUG. К нему сразу же присоединяются: инициаторная тРНК, несущая аминокислоту метионин, и белковые факторы инициации (начала) синтеза. После этого весь образовавшийся сложный комплекс прочно присоединяется к большой субъединице рибосомы, и в ней начинается синтез молекул белка.

В большой субъединице рибосомы есть 2 разных участка, связывающих молекулы тРНК: А-участок (служит для удерживания только что прибывшей молекулы аминоацил-тРНК. Поэтому его называют аминоацил-тРНК-связывающим участком) и П-участок (удерживает молекулу тРНК, присоединенную к растущему концу полипептидной цепи. Поэтому данный участок называют пептидил-тРНК-связывающим участком)

Элонгация — собственно синтез белка.

Первая аминоацил-тРНК, несущая аминокислоту, поступает на свободный А-участок, вторая подошедшая группа поступит на А-участок лишь тогда, когда первая группа передвинется на П-участок. Один из белков рибосомы (фермент пептидилтрансфераза), расположенный между двумя поступившими аминокислотами, катализирует образование пептидной цепи между сблизившимися аминокислотами. Одновременно с этим в П-участке связь первой поступившей аминокислоты с тРНК разрывается и происходит продвижение рибосомы на три нуклеотида вперед по иРНК в направлении 5' → 3'. Данное смещение приводит к тому, что свободная тРНК «выталкивается» из П-участка, а на это место передвигается вторая аминоацил-тРНК с аминокислотой. Одновременно освобождается А-участок для приема следующей аминоацил-тРНК, и весь процесс повторяется.

Терминация — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта.

Синтез белка продолжается до тех пор, пока рибосома не достигнет на мРНК особых терминирующих кодонов – стоп-кодонов UAA, UAG, UGA. Данные триплеты не кодируют ни одной из аминокислот, их также называют нонсенс-кодоны. При вхождении этих кодонов внутрь рибосомы происходит активация белковых факторов терминации, которые последовательно катализируют: гидролитическое отщепление полипептида от конечной тРНК, отделение от П-центра последней, уже пустой, тРНК, диссоциацию рибосомы.

Кодон и аникодон тРНК.

Антикодоном называют участок на петле молекулы тРНК, состоящий из трех нуклеотидов и узнающий соответствующий ему кодон – участок из трех нуклеотидов (триплет) в молекуле иРНК, с которым он может комплементарно взаимодействовать.

Открытые и закрытые рамки считывания.

Открытая рамка считывания (норма) - нуклеотидная последовательность гена, которая задается положением первого нуклеотида в первом инициирующем кодоне и заканчивается последним нуклеотидом терминирующего кодона. Число возможных Р.с. в каждой цепи ДНК три, так как генетический код триплетен. (Р.с. идет по триплетам).

AUG CCC GUU UAA -Открытая рамка считывания

Закрытая рамка считывания (не норма) - рамка считывания, внутри которой в результате мутации возникает стоп-кодон.

AUG CUA GAA UAG AAA UAC UAA –Закрытая рамка (в середине появился стоп)

Сдвиг рамки считывания (reading frame shift) — изменение нормальной рамки считывания гена в результате мутации, при которой происходит появление дополнительных нуклеотидов или, наоборот, утрата имеющихся нуклеотидов (одного или нескольких), но в количестве, не кратном трем.

AUG CUA GAA UAA C AA A UA C UA A – Появился новый нуклеотид и рамка сошла с ума.

Строение рибосомы эукариот и прокариот.

Прокариоты	Эукариоты
Несколько тысяч рибосом в клетке	В десятки раз больше
Маленькие	Большие
Состоят рибосомы из двух частей: большой и малой субъединиц. В их состав кроме белков входят РНК (рРНК).
70S* (30S малая суб.; 50S большая суб.)	80S* (40S малая; 50S большая)
	Соединениение рРНК с рибосомными белками происходит в ядрышке

*Величину рибосом и составляющих их частей принято указывать в специальных единицах - S (Сведберг). S - это коэффициент седиментации, который характеризует скорость перемещения молекул или частиц в центробежном поле при центрифугировании. Скорость перемещения зависит от массы частиц, их размеров и формы.