6. Конформационные формы молекулы днк. Денатурация и ренатурация днк. Температура отжига (плавления) днк.

Нуклеиновые кислоты имеют первичную, вторичную и третичную структуру.

Первичная структура ДНК

Первичной структурой ДНК называют линейную полинуклеотидную цепь, в которой мононуклеотиды соединены 3', 5'-фосфодиэфирными связями. Исходным материалом при сборке цепи нуклеиновой кислоты в клетке является нуклеозид 5'-трифосфат, который в результате удаления β и γ остатков фосфорной кислоты способен присоединить 3'-атом углерода другого нуклеозида. Таким образом, 3'-атом углерода одной дезоксирибозы ковалентно связывается с 5'-атомом углерода другой дезоксирибозы посредством одного остатка фосфорной кислоты и образует линейную полинуклеотидную цепь нуклеиновой кислоты.

Такое соединение, между остатком молекулы фосфорной кислоты одного нуклеотида и углеводом другого, приводит к образованию пентозо-фосфатного скелета молекулы полинуклеотида, на котором сбоку один за другим присоединяются азотистые основания.

Вторичная структура ДНК

Вторичная структура ДНК - это двойная спираль, модель которой была предложена Д.Уотсоном и Ф.Криком в 1953 году.

Согласно модели молекула ДНК состоит из двух комплементарных полинуклеотидных цепей. Каждая цепь ДНК представляет полинуклеотид, состоящий из нескольких десятков тысяч нуклеотидов. В ней соседние нуклеотиды образуют регулярный пентозо-фосфатный остов за счет соединения остатка фосфорной кислоты и дезоксирибозы прочной ковалентной связью.

Расположение азотистых оснований в цепи ДНК является комплементарным, т.е. против аденина (А) всегда оказывается тимин (Т), а против гуанина (Г) - только цитозин (Ц) (Между А и Т возникают две связи, между Г и Ц – три). Эти связи обеспечивают частичную стабилизацию молекулы ДНК в пространстве. Устойчивость двойной спирали при этом прямо пропорциональна числу связей G≡С, являющихся более стабильными по сравнению со связями А=Т.

Водородные связи между комплементарными основаниями (по горизонтали) и стекинг-взаимодействие между плоскостями оснований в полинуклеотидной цепи за счет ван-дер-ваальсовых сил (по вертикали) обеспечивает молекуле ДНК дополнительную стабилизацию в пространстве.

Сахарофосфатные остовы обеих цепей обращены наружу, а основания внутрь, навстречу друг другу.

Цепи образуют правые спирали с общей осью. Один виток спирали составляет 10 нуклеотидов, размер витка 3,4 нм, высота каждого нуклеотида 0,34 нм, диаметр спирали – 2,0 нм.

В результате вращения одной цепи вокруг другой, образуется большая борозда (диаметром около 20 Å) и малая борозда (около 12 Å) двойной спирали ДНК. Такая форма двойной спирали Уотсона-Крика в дальнейшем получила название В-формы.

Формы организации двухцепочечной ДНК

ДНК может формировать несколько типов двойных спиралей. В настоящее время уже известно шесть форм (от А до Е и Z-форма).

Структурные формы ДНК, как установила Розалинда Франклин, зависят от насыщения водой молекулы нуклеиновой кислоты. В исследованиях волокон ДНК при помощи рентгеноструктурного анализа было показано, что рентгенограмма радикальным образом зависит от того, при какой относительной влажности, при какой степени насыщения водой этого волокна происходит эксперимент.

Если волокно было достаточно насыщено водой, то получалась одна рентгенограмма. При высушивании возникала совершенно другая рентгенограмма, сильно отличающаяся от рентгенограммы волокна высокой влажности.

Молекула ДНК высокой влажности получила название В-формы. При физиологических условиях (низкая концентрация соли, высокая степень гидратации) доминирующим структурным типом ДНК является В-форма.

Шаг спирали такой молекулы равен 3,4 нм. На виток приходится 10 комплементарных пар в виде скрученных стопок "монет" - азотистых оснований. Стопки удерживаются водородными связями между двумя противолежащими "монетами" стопок, и "обмотаны" двумя лентами фосфодиэфирного остова, закрученными в правую спираль. Плоскости азотистых оснований перпендикулярны оси спирали. Соседние комплементарные пары повернуты друг относительно друга на 36°. Диаметр спирали 20Å, причем пуриновый нуклеотид занимает 12Å, а пиримидиновый - 8Å.

Молекула ДНК более низкой влажности получила название А-формы. А-форма образуется в условиях менее высокой гидратации и при более высоком содержании ионов Na⁺ или К⁺. Эта более широкая правоспиральная конформация имеет 11 пар азотистых оснований на виток. Плоскости азотистых оснований имеют более сильный наклон к оси спирали, они отклонены от нормали к оси спирали на 20°. Отсюда следует наличие внутренней пустоты диаметром 5Å. Расстояние между соседними нуклеотидами составляет 0,23 нм, длина витка – 2,5 нм, диаметр спирали – 2,3 нм.

А-форма ДНК в 10 раз устойчивее к действию УФ-лучей, чем В-форма.

А-форму и В-форму называют каноническими формами ДНК.

Формы С-Е также правоспиральные, их образование можно наблюдать только в специальных экспериментах, и, по-видимому, они не существуют in vivo.

С-форма ДНК имеет структуру, сходную с В-ДНК. Число пар оснований на виток составляет 9,33, длина витка спирали равна 3,1 нм. Пары оснований наклонены на угол 8 градусов относительно перпендикулярного положения к оси. В С-форму могут переходить природные и синтетические полинуклеотиды ДНК. 

К структурным элементам ДНК можно отнести необычные структуры, ограниченные какими-то специальными последовательностями:

Z-форма ДНК - образуется в местах В-формы ДНК, где пурины чередуются с пиримидинами или в повторах, содержащих метилированный цитозин. Палиндромы - последовательности-перевертыши, инвертированные повторы последовательностей оснований, имеющие симметрию второго порядка относительно двух цепей ДНК и образующие "шпильки" и "кресты". H-форма ДНК и тройные спирали ДНК - образуются при наличии в одной цепи нормального Уотсон-Криковского дуплекса участка, содержащего только пурины, и во второй цепи, соответственно, комплементарные им пиримидины. G-квадруплекс (G-4) - четырехцепочечная спираль ДНК, где 4 гуаниновых основания из разных цепей образуют G-квартеты (G-тетрады), скрепленные водородными связами с образованием G-квадруплексов.

Z-форма стала одним из важнейших структурных элементов ДНК в связи с тем, что ее образование наблюдалось в участках ДНК, где пурины чередуются с пиримидинами (например, 5’-ГЦГЦГЦ-3’), или в повторах 5’-ЦГЦГЦГ-3’, содержащих метилированный цитозин. Существенным условием образования и стабилизации Z-ДНК являлось присутствие в ней пуриновых нуклеотидов в син-конформации, чередующихся с пиримидиновыми основаниями в анти-конформации.

Полагают, что участки Z-ДНК играют определенную роль в регуляции экспрессии некоторых генов и принимают участие в генетической рекомбинации.

Z-форма ДНК - это левозакрученная двойная спираль, в которой фосфодиэфирный остов расположен зигзагообразно вдоль оси молекулы. Отсюда и название молекулы (zigzag)-ДHK. Z-ДНК - наименее скрученная (12 пар оснований на виток) и наиболее тонкая из известных в природе. Расстояние между соседними нуклеотидами составляет 0,38 нм, длина витка – 4,56 нм, диаметр Z-ДНК – 1,8 нм. Кроме того, внешний вид этой молекулы ДНК отличается наличием одной бороздки.

Z-форма ДНК была обнаружена в клетках прокариот и эукариот. В настоящее время получены антитела, способные отличать Z-форму от В-формы ДНК.

Третичная структура ДНК

Третичная структура ДНК образуется в результате дополнительного скручивания в пространстве двуспиральной молекулы - ее суперспирализации. Суперспирализации молекулы ДНК в эукариотических клетках в отличие от прокариот осуществляется в форме комплексов с белками.

Денатурация и ренатурация ДНК

Водородные связи и межплоскостные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль, достаточно слабы, и при относительно небольших воздействиях происходит разделение цепей - процесс, именуемый денатурацией, или плавлением.

Двухцепочечная спиральная ДНК в растворе легко разрушается при нагревании до температур, близких к 100°С. Денатурация происходит также при увеличении рН раствора до уровня, при котором разрушаются водородные связи между основаниями.

Многие факторы влияют на денатурацию, нейтрализуя частично или полностью отрицательно заряженные фосфатные группы остова молекулы. Интервал значений температуры или рН, при которых происходит разделение цепей, очень невелик. Поскольку для разрушения двух водородных связей АТ-пар требуется меньше энергии, чем для разрыва трех водородных связей GС-пар, значения температуры и рН, при которых происходит денатурация, зависят от нуклеотидного состава ДНК. Чем выше содержание GС-пар, тем выше Тт или рНт.

Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при понижении температуры или рН. Если температура или рН понижаются постепенно, то цепи соединяются правильно, с восстановлением всех исходных пар оснований. При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей. 

Температура плавления ДНК (Tm) – это температура, при которой цепи ДНК диссоциированы наполовину

 Грубое вычислениетемпературы плавления (T_m) короткого олигонуклеотида (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчетуколичества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов, L - длина олигонуклеотида):

Tm=2(C+G+L)