- •3. Нуклеосома как единица структурной организации хроматина. Октамер гистонов в составе нуклеосомы. Линкер и линкерный гистон.
- •4. Полуконсервативный механизм репликации днк. Опыт Мезельсона и Сталя (1958).
- •5. Свойство анипаралленльности цепей в молекуле днк. Биологический смысл. Правило Чаргаффа.
- •6. Конформационные формы молекулы днк. Денатурация и ренатурация днк. Температура отжига (плавления) днк.
- •Вопрос 7
- •Вопрос 8
- •Вопрос 9
- •11. Транскрипция у прокариот. Основные этапы транскрипции: инициация, элонгация, терминация. Регуляция транскрипции (в вопросе 10).
- •12. Транскрипция у эукариот. Основные этапы транскрипции: инициация, элонгация, терминация. Регуляция транскрипции (в вопросе 10).
- •16. Рекомбинантная днк. Инструментарий для создания рекомбинантных молекул днк.
- •17. Системы рестрикции-модификации (r-m системы), их биологическая роль.
- •19. Клонирование днк in vitro.
- •21. Плазмиды. Плазмидные векторы для клонирования in vivo. Методы трансформации плазмидной днк. Скрининг (отбор) трансформированных бактериальных клеток.
- •22. Получение библиотеки геномной днк с помощью плазмидных векторов.
- •24. Плазмидный вектор для экспрессии гена. Экспрессионные векторы.
- •30. Метод гель-электрофореза. Назначение метода и принцип его действия. Разделение и анализ фрагментов днк. Маркеры молекулярного веса днк. Красители, применяемые при проведении гель-электрофореза.
- •31. Пцр и ее применение
- •Подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к выделению днк или рнк;
- •Собственно полимеразной цепной реакции;
- •Детекции продукта пцр (амплифицированной нуклеиновой кислоты).
11. Транскрипция у прокариот. Основные этапы транскрипции: инициация, элонгация, терминация. Регуляция транскрипции (в вопросе 10).
Транскрипция – это процесс синтеза РНК на матрице ДНК, происходящий во всех живых клетках. Этапы транскрипции: Инициация (узнавание ДНК-промотора и сборка РНК-полимеразы), элонгация (синтез пре-мРНК), терминация (остановка синтеза пре-мРНК, распад РНК-полимеразы).
РНК-полимераза синтезирует полинуклеотидную цепочку РНК из рибонуклеозидтрифосфатов, используя одну цепь ДНК в качестве матрицы (антисмысловая или некодирующая цепь). Клетки содержат несколько типов РНК: матричные РНК (мРНК), рибосомальные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК) и малые РНК. Транскрипция начинается с промоторной последовательности (промо́тора), с которой связывается РНК-полимераза.Синтез цепи происходит в направлении 5’→ 3’. Некоторые гены экспрессируются конститутивно (т.е. постоянно), остальные регулируются с помощьюбелков-регуляторов(ингибиторов или активаторов) и экспрессируются индуцибельно (при действии определенного стимула).
Инициация — это первая стадия транскрипции, в ходе которой происходит
сборка транскрипционного комплекса, расплетение спирали ДНК и синтез короткого фрагмента РНК.
У прокариот процесс начинается с того, что прокариотический σ-фактор(«сигма»-факторили субъединица)РНК-полимеразы «узнаёт» промо́тор и связывается с ним. Промотор — фрагмент цепи ДНК досайта начала транскрипции, включающий два участка:–10(бокс Прибнова) и–35. Затем кσ-фактору присоединяется кор-фермент РНК-полимеразы(комплекс субъединиц α2ββ’ω) и корректно располагается на промоторе для инициации транскрипции(σ-фактор повышает сродствоРНК-полимеразы к промотору). Формируется закрытый ком-
плекс.
Далее РНК-полимераза меняет конформацию, её β’- и σ-субъединицы инициируют разделение цепей ДНК (отрезок длиной в 14 нуклеотидов), формируется транскрипционный пузырёк и открытый комплекс. Затем σ субъединица отделяется, к РНК-полимеразе присоединяются дополнительные белки, включаяNusA, и полимераза продвигается по цепи ДНК, покидая промотор.
Элонгация — это вторая стадия транскрипции, в ходе которой происходит синтез цепи РНК. Он осуществляется в направлении 5’→ 3’ (подобно синтезу ДНК в репликации).
В месте синтеза участок ДНК расспирализован, связи между полинуклеотидными цепями ДНК разорваны для того, чтобы РНК-полимераза могла «считать» информацию с антисмысловой цепи ДНК. Растущая РНК и участок ДНК формируют гибрид РНК-ДНК.
Элонгация транскрипции происходит непрерывно: РНК-полимераза не отщепляется от матричной цепи ДНК. Скорость транскрипции у кишечной палочки E. coli составляет20–50нуклеотидов в секунду при 37°С. Частота ошибок — 1 ошибка на каждые ~104 нуклеотидов.
Как только РНК-полимераза покинула промотор, другая молекула РНК-поли-меразы может присоединиться к промотору и инициировать синтез РНК. Некоторые гены (например, гены рРНК) транскрибируются с высокой частотой: инициация синтеза РНК на них может происходить 1 раз в секунду.
Терминация — это заключительная стадия транскрипции, на которой
происходит остановка синтеза и отщепление цепочки РНК, а также всего транскрипционного аппарата. Терминация происходит по двум механизмам в специальных сайтах.
Согласно первому механизму, на конце синтезируемого транскрипта РНК образуется шпилька, нарушающая связи между цепями ДНК и РНК. Фрагмент цепи, на котором происходит остановка синтеза, называют терминатором. Он имеет два структурных элемента:
1.Участок, богатый парами G • C и формирующий шпильку.
2.Участок из 4–10пар A • T (аденин на некодирующей цепи ДНК, с которой идёт считывание). Транскрипция терминируется на или сразу после этой последовательности.
Этапы терминации по первому механизму:
1.РНК-полимеразасинтезирует два комплементарных участка из пар G • C. Они образуют шпильку.
2.РНК-полимеразаостанавливается на участке пар A • T и меняет конформацию. В результате гибрид РНК-ДНК диссоциирует: синтезированная цепь РНК отщепляется и вслед за ней от ДНК отщепляется РНК-полимераза.
Второй механизм терминации требует участия ρ-фактора («ро»-фактора), белка, способного разрывать связи между новой цепью РНК и цепью ДНК (т.е. обладающего хеликазной активностью). Модель ρ-зависимой терминации:
1.ρ-Фактор связывается с растущей цепью РНК в особом участке узнавания и движется в направлении 5’→ 3’, пока не встретит РНК-полимеразу, остановившуюся на участке терминации — последовательность из 80100 нуклеотидов, богатых цитозином.
2. ρ-Фактор«толкает»РНК-полимеразувперёд и сворачивает диссоциированные цепи ДНК в транскрипционном пузырьке в двойную спираль, одновременно с этим разрывая гибрид РНК-ДНК.РНК отщепляется, а вслед за ней — иРНК-полимераза.