- •Министерство сельского хозяйства Российской Федерации
- •Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по патологической физиологии
- •Тема 1. Физиологическая и патологическая регуляция функций
- •Общая этиология и патогенез. Действие болезнетворных факторов на организм животных
- •Тема 3. Действие повышенной и пониженной температуры окружающей среды на организм
- •Тема 4. Действие лучистой энергии
- •Тема 5. Влияние электрического тока на организм животных
- •Тема 6. Артериальная и венозная гиперемия. Ишемия
- •Тема 7. Тромбоз и эмболия
- •Воспаление
- •Тема 8. Расстройство кровообращения и эмиграция лейкоцитов при остром воспалении
- •Тема 9. Морфологические и биохимические свойства гнойного экссудата
- •Тема 10. Фагоцитоз
- •Болезнетворные факторы
- •Воспаление
- •Тема 11. Зависимость развития патологического процесса от состояния центральной нервной системы, факторов внешней среды и возраста
- •Тема 12. Изучение защитных свойств организма
- •Иммунопатология
- •Тема 13. Аллергия и аллергические заболевания
- •Тема 14. Местные проявления анафилаксии
- •Тема 15. Реакция антигена с антителом
- •1. Получение и обработка испытуемой сыворотки
- •2. Приготовление 2,5% взвеси эритроцитов
- •3. Приготовление гемолизина
- •4. Приготовление комплемента
- •5. Приготовление антигена
- •Тема 16. Лихорадка
- •Тема 17. Отек и водянка
- •Патология системы крови
- •Тема 20. Лейкоцитарная формула и ее изменение при патологии. Лейкозы (2 часа)
- •Патология общего кровообращения
- •Тема 22. Сердечная недостаточность кровообращения (2 часа)
- •Тема 23. Нарушение ритма сердечной деятельности (2 часа)
- •Тема 24. Нарушение внешнего и внутреннего дыхания
- •Тема 25. Нарушение дыхания при поражении головного мозга и грудной полости (2 часа)
- •Патология кровообращения
- •Раздел XII патология пищеварения
- •Тема 26. Патология пищеварения в желудке (2 часа)
- •Тема 27. Кислотность желудочного сока при различных секреторных нарушениях желудка (2 часа)
- •Тема 28. Влияние экстракта содержимого желудка, тонкого и толстого отделов кишечника на кровообращение и дыхание (2 часа)
- •Патология печени
- •Тема 29. Нарушение желчеобразовательной и желче-выделительной функции печени. Желтухи (2 часа)
- •Тема 30. Количественное и качественное изменение мочи при нефрозо-нефритах (2 часа)
- •Тема 31. Влияние на организм нарушений инкреторной функции гипофиза, надпочечников, щитовидной и поджелудочной желез
- •Тема 32. Нарушение движений и чувствительности
- •Тема 1. Физиологическая и патологическая регуляция, функций 4
- •Тема 3. Действие повышенной и пониженной температуры окружающей
1. Получение и обработка испытуемой сыворотки
Кровь для исследования берут по общепринятой методике. Исследуемые по РСК сыворотки предварительно подвергают инактивации путем нагревания на водяной бане при +56—58° в течение 30 мин в день постановки реакции.
2. Приготовление 2,5% взвеси эритроцитов
Кровь берут из яремной вены барана в банку со стеклянными бусами. Дифибринируют кровь путем встряхивания в течение 10—15 мин, затем ее фильтруют через 2—3 слоя марли, разливают по центрифужным пробиркам, добавляют физиологический раствор и центрифугируют в течение 10—116 мин при 1500—2000 об./мин. Отмывают эритроциты 3—4 раза до получения прозрачной жидкости над осадком эритроцитов. Последнюю промывную жидкость тщательно отсасывают, а из осадка берут 2,5 мл эритроцитов и 97,5 мл физиологического раствора. Получают 2,5% раствор.
3. Приготовление гемолизина
Гемолизин изготовляют на биофабриках. Гемолизин (гемолитическую сыворотку) получают путем иммунизации кроликов. Для этого кроликам многократно вводят подкожно, а чаще внутривенно, отмытые эритроциты барана, в нараста-
51
ющем количестве с интервалом в 2 дня. Например: 1-е введение — 0,26 мл осадка эритроцитов в 2,5 мл физраствора, 2-е — 0,5, 3-е — 0,75 и т. д.
На 3—5-й день после последней инъекции эритроцитов у кроликов берут кровь для предварительного определения титра. Если титр сыворотки не менее 1:2000, то в этот день кроликов обескровливают.
Консервируют полученную от этих кроликов сыворотку чистым стерильным глицерином; через 2—3 дня определяют титр консервированных сывороток от каждого кролика в отдельности,
4. Приготовление комплемента
В качестве комплемента берут свежую сыворотку крови морской свинки. Кровь от морских свинок можно получать разными способами.
Пункция сердца. Свинку фиксируют на столе в спино-бо-ковом положении. Большим и указательным пальцами левой руки прощупывают с обеих сторон грудную клетку, по толчкам определяют положение сердца. Правой рукой вводят в грудную полость иглу шприца. От взрослой свинки берут 5—16 мл крови. Полученную кровь помещают на 15—20 мин в термостат. После свертывания крови сыворотку отсасывают и сохраняют для использования в качестве комплемента в леднике.
5. Приготовление антигена
При изготовлении антигена отбирают наиболее вирулентные штаммы микробов, засевают на печеночный агар и выращивают в термостате при температуре +37°С. После 2— 3-суточного роста культуры проверяют макро- и микроскопически на чистоту. Отобранные матрицы смывают физиологическим раствором с 0,5% карболовой кислоты. Полученную взвесь микробов фильтруют и подвергают кипячению в водяной бане 30 мин, далее отстаивают 2—3 дня. Жидкость удаляют, а бактерийную массу разводят физиологическим раствором с 0,5% карболовой кислоты до концентрации 40 млрд. микробных тел. Полученную взвесь выдерживают в течение 3 месяцев, затем жидкость отделяют центрифугированием и используют в качестве антигена.
52
Определение титра гемолизина. Титрование производится для определения предельной гемолизирующей способности гемолизина.
Титром гемолизина называется минимальное его количество, необходимое для полного гемолиза 0,5 мл взвеси эритроцитов в присутствии комплемента при температуре +37— —38°С в течение 10 мин.
Для .титрования необходима иметь пробирки, пипетки термостат, штатив, физраствор, гемолитическую сыворотку, из которой нужно приготовить основное разведение гемолизина.
Получение основного разведения. Берется 0,1 мл гемолизина и 9,9 мл физраствора. Получается основное разведение 1:100,
Получение разведений гемолизина. Разведение гемолизина от 1:200 до (1:2500 производится по схеме Ь Титрование гемолизина производится по схеме \2. (Каждого разведения берется по 0,6 мл в отдельную пробирку. В каждую пробирку добавить по 1 мл физраствора, по 0,5 мл комплемента и по 0,5 мл эритроцитов. Кроме этого, ставится контроль в 3 пробирки.
Пробирка № 13 — контроль гемолизина.
Пробирка № 14 — контроль комплемента.
Пробирка № 15 — контроль физраствора.
Штатив с пробирками ставят в водяную баню на 10 мин. Через '10 мин находят наибольшее разведение гемолизина, при котором произошел полный гемолиз эритроцитов. Это разведение и будет титром гемолизина. Например, он будет равен 1:600. Для проведения титрования остальных компонентов PСK берется двойное количество гемолизина. Это удвоенное количество гемолизина называется рабочим титром.
Титрование комплемента. Титром комплемента называется наименьшее количество комплемента, необходимое для полного гемолиза 0,5 мл взвеси эритроцитов при рабочей дозе гемолизина и 10-минутного нахождения ингредиентов в водяной бане при температуре +37—+38°С.
Методика титрования комплемента. Титрование производят по схеме 3. В штатив ставят 8 пробирок и в каждую из них наливают по 0,5 мл гемолизина в рабочем титре, комплемента и физраствора и по 0,6 мл взвеси эритроцитов. Штатив ставят на 10 мин в водяную баню при +38°С. Первая пробирка в штативе с гемолизом и будет тем количеством
53
Схема разведения гемолизина
Берется гемолитической сыворотки в разведении 1:100 |
Прибавляется физраствор |
Получается гемолитическая сыворотка в разведении |
0,5 0,5 1:200
0,25 0,75 1:400
0,2 1 1:600
0,2 1,4 1:800
0,1 0,9 1:1000
0,1 1,1 1:1200
0,1 1,3 1:1400
0,1 1,5 1:1600
0,1 1,7 1:1800
0,1 1,9 1:2000
0,1 2,4 1:2500
2. Схема титрования гемолизина
№ пробирки |
Разведение гемолизина |
Кол-во взятого комплемента, мл |
Физ. р-р, мл |
Взвесь эритроцитов, мл |
1 1:100 0,5 0,5 1,0 0,5
2 1:200 0,5 0,5 1,0 0,5
3 1:400 0,5 0,5 1,0 0,5
4 1:600 0,5 0,5 1,0 0,5
5 1:800 0,5 0,5 1,0 0,5
6 1:1000 // // // //
7 1:1200 // // // //
8 1:1400 // // // //
9 1:1600 // // // //
10 1:1800 // // // //
11 1:2000 // // // //
12 1:2500 // // // //
13 К-ль гемолизина
1:100 0,5 --- 1,5 0,5
14К-ль комплемента --- 0,5 1,5 0,5
15К-ль физ. рра --- --- 2,0 0,5
комплемента, которое необходимо для постановки реакции связывания комплемента.
54
Постановка реакции связывания комплемента. Сущность реакции состоит в том, что антиген с соответствующим ему антителом извлекает из сыворотки морской свинки содержащийся в ней комплемент и связывает его (адсорбирует).
3. р
3. Схема титрования комплемента
№ пробирки |
Гемолизин в рабочем титре |
Комплемент, мл |
Физ. р-р, мл |
Взвесь эритроцитов, мл |
1 0,5 0,15 1,35 0,5
2 0,5 0,2 1,3 0,5
3 0,5 0,25 1,25 0,5
4 0,5 0,3 1,2 0,5
5 0,5 0,35 1,15 0,5
6 0,5 0,4 1,1 0,5
7 0,5 0,45 1,05 0,5
8 Контроль комплемента
нет 0,45 1,55 0,5
4.Схема постановки реакции связывания комплемента
№ про-бирки |
Испы-туемая сыво-ротка |
Антиген |
Комп-лемент |
Ставится в водяную баню на 10 мин |
Гемо-лизин |
Эрит-роциты |
Физ. Р-р |
1 0,5 0,5 0,35 0,5 0,5 0,15
2 0,5 0,5 0,35 0,5 0,5 0,15
3 контроль --- --- 0,5 0,5 1,5
4 контроль --- 0,35 --- 0,5 1,65
5 контроль --- --- --- 0,5 2,0
Вопросы по теме
Принципы приготовления компонентов реакции связы- вания комплемента (РСК) и основные этапы ее проведения.
Чем обусловлена специфическая и неспецифическая ре активность?
55
ПАТОЛОГИЯ ТЕПЛОВОЙ РЕГУЛЯЦИИ