17. Реакции с участием меченых антигенов и антител: риф, ифа, риа, иэм.

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ. Различают 3 разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Явл методом экспресс-диаг для выявл антигенов микробов или опред антител. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тк или микробы, обработанные иммун сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФИ люминесцентного микроскопа. Бак в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии кл в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявл комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностич сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе. Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностич наборов, быстротой получения ответа. Основным недостатком РИФ является ее субъективность. Радиоиммунный анализ (РИА) - высокочувствит метод, основанный на р-ции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, ЗН, 51Сг). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммун комплекс и опред его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна кол-ву связавшихся молекул антигена и антител. Иммуиоферментный анализ (ИФА) - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммун сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта р-ции - интенсивность окраски прямо пропорциональна кол-ву связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА - вариант теста, когда 1 из компонентов иммун – р-ции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, н, в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При полож результате изменяется цвет хромогена. Достоинства ИФА: высокая чувствит, позволяющая выявлять концентрации антигена до 10 пг/мл; высокая стандартность и воспроизводимость; возможность испол минимальные объемы исслед материала; стабильность при хранении всех ингредиентов, необход для проведения ИФА (до года и более); простота проведения р-ции; наличие как инструментального (в кач-ном и колич-ном варианте), и визуального учета; возможность автоматизации всех этапов р-ции; относительно низкая стоимость диагностич наборов и оборудования. Применение ИФА: диаг инфекц заб: обнаружение антигенов возбуд; обнаружение антител к антигенам возбуд; мониторинг заб, опред ответа на терапию, прогноза развития заб и его исхода; контроль поствакцинального иммунитета; диаг аутоиммунных заб: опред аутоантител; диаг аллергич заб: опред общего и специфич IgE; опред продуктов активированных эозинофилов, базофилов и тучных кл; диаг злокач опухолей: опред в сыворотке маркеров опухолевого роста; фенотипирование опухолевых кл (тк) для уточнения происхождения и дифференцировки опухоли; опред концентрации гормонов, параметров менструально-овуляторного цикла; диаг беременности; опред концентрации лп; опред допинга; опред загрязнения окр среды. Иммуноблоттинг – метод, позволяющий одновр выявлять специфич антитела к спектру антигенов (к каждому из них) в сыворотке или др материале. ИБ основан на тИФА; в отличие от тИФА в планшетах обладает большей специфичностью, но меньшей чувствит. Этапы постановки ИБ: 1. Подготовка антигенов: лизис/дезинтеграция вирусов, бак; обработка додецил сульфатом натрия для придания всем компонентам схожего соотношения отриц заряд/молекулярная масса. 2. Получение блотов: разгонка антигенов в электрофорезе (пропорционально размеру); перенос антигенов на мембрану; разрезание мембраны на блоты (полоски, содержащие спектр антигенов) . 3. Проведение р-ции: обработка блота сывороткой больного (специфич антитела больного связываются с соответствующими антигенами);выявление связавшихся антител антивидовыми антителами к иммуноглобулинам чела, меченными ферментом; внесение субстрата и проявление блотов (при связывании специфических антител в месте связывания образуется пятно); 4. Учет р-ции (сравнение результата с полож и отрицат контролями) и выдача заключения. ИБ применяют для: подтверждения результатов др серологич р-ций; идентификации бактериал или вирусных белков; идентификации микробов; научных целей. Иммун электронная микроскопия - электрон микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующ антителами. Вирусы, обработанные иммун сывороткой, образуют иммун агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется "венцы" из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой к-той или др электроннооптически плотными препаратами. К антигену, н, к вир гриппа, присоед специфич антисыворотка, меченая электроноплотным в-вом. В кач-ве метки примен металлосодержащие белки (ферритин, гемоцианин) или коллоидное золото. При микроскопии в электронном микроскопе делают фотографии, на кот видны вирионы гриппа с присоединившимися к ним тёмными точками - молекулами меченых антител.