14. Понятие об антителах. Хим природа, структура, классы иммуноглобулинов. Моноклонал антитела

Строение молекулы иммуноглобулина: Fab-фрагмент-это активн центр АТ, место где происходит связывание с АГ. Fc-фрагмент-осущ эффекторные ф-ции: связывание с рецепторами, кот экспрессированы на кл орг (н, фагоцитах) Антитела, вырабатываемые иммун кл, принадлежащ к 1му клет клону, т е произошедшими из 1ой плазматич кл-предшественницы. Моноклональные антитела м б выработаны против почти любого природного антигена, кот антитело будет специфически связывать. Они м б далее испол для детекции этого в-ва или его очистки. Антитела – белки (гликопротеины) сыворотки крови, образующ в ответ на введение антигена и обладающие способн специфически взаимодействовать с антигенами, кот вызвали их образование (совокупность сывороточных белков, несущая антительную активность, и относ к γ-глобулинам, получила назв иммуноглоб и Ig). Ф-ции антител:Распознавание и связывание антигена с целью его нейтрализ и последующей элиминации.Антитоксич эффект (связывают и инактивируют бактериал токс).Цитотоксич эффект (стимулируют разрушение антигенов цитотоксическими кл). Активация комплемента.Опсонизация фагоцитоза.Участие в развитии аллергич р-ций. Обеспечение иммунологич памяти и толерантности.  Обеспечение кооперации иммунокомпетентных кл.  Иммунорегулирующие св-ва. IgM - антитела, кот 1ми производятся в ответ воздействие антигена. IgG - самый многочислен класс антител. Они производятся в ответ на повтор возд-вие антигена (могут переходить через плацентарный барьер). IgA - антитела, кот защищают орг от вторжения микроорг через слиз оболочки. IgE - антитела, кот вызывают немедленные аллергич р-ции, важны в борьбе против паразитарных заб. IgD - антитела, присутствующие в очень небольшом кол-ве в циркулирующей крови. Их ф-ция до конца не понятна.

15. Динамика антителообразования. Особенности вторич иммун ответа. Иммунологич память.

Способность к образованию ан­тител появл во внутриутробном периоде у 20-нед эмбриона; после рождения начинается собственная продукция иммуноглобулинов, кот увелич до наступления зре­лого возраста и несколько снижается к старости. Динамика об­раз антител имеет различный характер в зависимости от силы антигенного воздействия (дозы антигена), частоты воздействия антигена, состояния орг и его иммун сис-мы. При первич и повтор введении антигена динамика антителообраз также различна и протекает в неск стадий. Выдел латентную, логарифмическую, стационарную фазу и фазу снижения. В латентной ф происходят переработка и представление антигена иммунокомпетентным кл, размножение клона кл, специализированного на выработку антител к данному антигену, начинается синтез ан­тител. В этот период антитела в крови не обнаруживаются. Во вр логарифмич ф синтезированные антитела высво­бождаются из плазмоцитов и поступают в лимфу и кровь. В ста­ционарной ф кол-во антител достигает максимума и стабилизируется, затем наступает ф снижения ур антител. При первич введении антигена (первич иммун ответ) латентн ф составляет 3—5 сут,логарифмич—7—15 сут, стационарн—15—30 сут и ф снижения—1—6 мес. и более. Особен первич иммун ответа явл то, что первоначально синтезируется IgM, а затем IgG. В отличие от первич иммун ответа при вторич введении антигена (вторич иммун ответ) латентный период укорочен до нескольких ч или 1—2 сут, логарифми­ч фаза характ быстрым нарастанием и значитель­но более высоким ур антител, кот в последующих фазах длит удерживается и медленно, иногда в течение не­ск лет, снижается. При вторич иммун ответе в отличие от первич синтезируются глав обр IgG. Такое различие динамики антителообразования при первич­ и вторич иммун ответе объясняется тем, что после первич введ антигена в иммун сис-ме формирует­ся клон лимфоцитов, несущих иммунологич память о данном антигене. После повтор встречи с этим же антиге­ном клон лимфоцитов с иммунологич памятью быстро раз­множается и интенсивно вкл процесс антителогенеза. Очень быстрое и энергичное антителообразование при повтор­ встрече с антигеном испол в практич целях при необходимости получения высоких титров антител при производстве диагностич и лечеб сывороток от иммунизир животных, а также для экстренного создания иммуни­тета при вакцинации.

16. Р-ции иммунитета: механизм, ингредиенты, практич применение, способы постановки. Р-ции нейтрализации токсина антитоксинами; р-ция преципитации, р-ция агглютинации; РНГА; РСК

Реакции иммунитета с испол меченых антигенов и антител основаны на том, что 1 из ингредиентов, участвующих в р-ции (антигены или антитела), соед с какой-либо меткой, кот легко можно обнаружить. В кач-ве метки испол флюорохромы (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные соединения (ИЭМ). Иммуноферментный анализ (ИФА), как и др р-ции иммунитета, испол: 1) для опред неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявл антител в сыворотке крови с помощью известного антигена. Особен р-ции в том, что известный ингредиент р-ции соединён с ферментом (н, пероксидазой). Присутствие фермента опред с помощью субстрата, кот при д-вии фермента расщепляется и среда окраш. Наиб широко применяется твёрдофазный ИФА. 1. Обнаружение антигена. 1ый этап - адсорбция специфич антител на тв фазе, в кач-ве кот испол полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей. 2ой э - добавлен исслед материала, в кот предполаг наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого лунки промывают. 3ий э - добавление специфич сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. Меченые антитела присоед к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Т о, если в исслед материале имеются антигены, на поверхности тв фазы образуется комплекс антитела-антиген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилендиамин в смеси с Н2О2 в буфер р-ре. Под д-вием фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску. 2. Обнаружение антител. 1ый э - адсорбция специфич антигенов на стенках лунок. Обычно в коммерческих тест-сис-мах антигены уже адсорбированы на поверхности лунок. 2ой э- добавление исслед сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитело. 3ий э - после отмывания в лунки добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против человеч глобулинов), меченые ферментом. Результаты р-ции оценивают, как указано выше. Р-ция нейтрализации токс антитокс основана на способности антитоксич антител связывать токсин и блокировать его д-вие. Для идентификации токс и опред титра антитоксич антител их смесь вводят лаб животным. При диагн некот инфекц заб, возбуд кот продуцируют экзотокс, испол р-цию нейтрализации токс антитокс. Для ее проведения исслед материал, в кот подозревают наличие токс, смешивают с соответст антитоксич сывороткой и после инкубации в термостате вводят лаб животным (белые мыши, морские свинки). Контрольным животным вводят только исслед материал. Если взятая в опыт антитоксич сыворотка нейтрализует токсин, животные останутся живы. Контрол животные гибнут под д-вием токс. Р-ция нейтрализации испол для выявл токсинов возбуд ботулизма, столбняка, газовой гангрены. Часто для опред активности иммун антитоксических сывороток анатоксинов испол р-ция нейтрализации по механизму флоккуляции. Р-ция преципитации (РП) – это осаждение р-р антигена при д-вии антител в присутствии электролита. Видимый эффект р-ции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата). РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекц заб: при сибирск язве, туляремии, менингите, оспе. В судебной медицине ее испол для опред видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенич исслед – для уст фальсификации пищ продуктов. РП отличается очень высокой чувствит и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000. Компоненты р-ции преципитации. 1. Антиген (преципитиноген) - это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (р-мом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тк. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры кл (это не разрушенные целые кл), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Р-р преципитиногена прозрачный. 2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови чела или в иммун диагностич преципитирующих сыворотках, кот содержат известные антитела 3. Электролит – изотонический р-р хлорида натрия. 1. Р-ция кольцепреципитации – проводится в спец преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же кол-во преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально. Учет результатов р-ции проводят по появл белого кольца на границе антиген-антитело. При + р-ции наблюдается образ такого кольца. В этом случае антиген соответст антителу и происходит их связывание. Если в кач-ве преципитиногена испол прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тк, то р-ция называется р-цией термокольцепреципитации (н, при диаг сибирск язвы). 2. Р-ция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в кот помещают антигены или антитела, или и то и др. Различают 2 метода РП в геле: а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: 1 из компонентов р-ции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а др компонент – смешивают с агаром; при+ результате (антиген соответ антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата; б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при + результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации. Примером РП в геле явл р-ция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагн дифтерии Иммуноэлектрофорез – это метод, кот сочетает метод электрофореза и р-цию преципитации. Смесь антигенов (н, белков сыворотки крови) разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем, чтобы найти и опред нужный белок (неизвестный антиген), испол диагностич преципитирующ сыворотку, кот содержит антитела к этому белку (известное антитело). Для этого в канавку параллельно белкам вносится диагностич сыворотка. Если среди белков имеется тот, кот соответств антителу, находящемуся в сыворотке, то вокруг него образуются линии преципитации Р-ция агглютинации (РА) - это иммун р-ция взаимодействия антигена с антителами в присутствии электролитов, причем антиген находится в корпускулярном состоянии (эритроциты, бак, частицы латекса с адсорбированными антигенами). При агглютинации происход склеивание корпускулярных антигенов антителами, что проявл образованием хлопьевидного осадка. Образование хлопьев происходит за счет того, что антитела имеют 2 активных центра, а антигены поливалентны, т.е. имеют несколько антигенных детерминант. РА применяют для идентификации возбуд, выделенного из материала больного, а также для обнаружения в сыворотке крови больного антител к возбуд (н, р-ции Райта и Хеддлсона при бруцеллезе, р-ция Видаля при брюшн тифе и паратифах). Самый простой способ постановки РА – р-ция на стекле, это ориентировочная РА, кот применяется для опред возбуд, выделенного от больного. При постановке р-ции на предметное стекло наносят диагностич агглютинирующ сыворотку (в разведении 1:10 или 1:20), затем вносят культуру от больного. Р-ция +, если в капле появл хлопьевидный осадок. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю р-ра натрия хлорида. Если диагностич агглютинирующая сыворотка неадсорбированная¹, то ее разводят (до титра - разведения, до кот должна происходить агглютинация), т.е. ставят развернутую РА в пробирках с увеличивающ ¹ Неадсорбированная агглютинирующ сыворотка может агглютинировать родственные бак, имеющие общие (перекрестно реагирующие) антигены. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из кот удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родствен бак. В таких сыворотках сохр антитела, специфичные только к данной бак. РСК: Р-ция связывания комплемента (РСК) – это сложная серологич р-ция, в кот участвуют 2 сис-мы антиген-антитело и комплемент. 1-ая сис-ма – специфич, 2-ая – гемолитич сис-ма. Эта р-ция разработана Ж.Борде и О.Жангу, кот уст, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается, поэтому для выявл связывания комплемента (а след, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в кач-ве индикатора испол 2-ая – гемолитич сис-ма. РСК испол чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбуд заб в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заб. РСК также испол для сероидентификации. Компоненты РСК. 1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген м б как корпускулярным (нерастворим), так и молекулярным (растворим). 2. Антитело – сыворотка крови больного чела (при серодиагностике) или иммунная диагностич сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации). 3. Эритроциты барана – антигены гемолитич р-ции. 4. Гемолитич сыворотка – сыворотка, содерж антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана. 5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная). 6. Электролит – изотонич р-р хлорида натрия. Постановка РСК. Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитич сыворотка и комплемент титруются (опред их титр). Сыворотка больного прогревается при 56С в теч 30 мин. РСК проводят в 2 фазы. I ф – специфич: в 1ой пробирке готовят специфич сис-му - смешивают равные кол-ва известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в др пробирке готовят гемолитич сис-му – смесь эритроцитов барана и гемолитич сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37С на 30 мин. Одновр готовят контроли на антиген, комплемент и гемосис-му, контрол пробы с сывороткой заведомо больного чела (+сыворотка) и заведомо здорового чела (-сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин. II ф – индикаторная: в исходную смесь и во все контрол пробирки добавляют одинаковые кол-ва гемолитич сис-мы и учитывают результаты р-ции после выдерживания в термостате 30 мин. Учет результатов РСК проводят при безупречных результатах в контролях. +р-ция (чел болен и в его сыворотке имеются соответст антитела к возбуд заб - антигену): в I ф в специфич сис-ме образуются комплексы антиген-антитело, с кот связывается комплемент, после добавления гемолитич сис-мы во II ф гемолиз не наблюдается, т к комплемент связан 1-ой специфич сис-мой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов. - р-ция (чел здоров и в его сыворотке нет антител к возбуд заб): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I ф остается свободным, после добавления гемолитич сис-мы во II ф комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь". В диагностике инфекц заб также испол р-ция нейтрализация (РН) токсина антитоксич сывороткой, р-ция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА). Р-ция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на испол эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие кот с соот­ветст антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. Компоненты. Для постанов­ки РНГА м б испол эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, чела и др., кот заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Адсорбционная емкость эритроцитов увелич при обработке их р-рами танина или хлорида хрома. Антигенами в РНГА могут служить полисахар АГ микро­орг, экстракты бактериал вак, АГ вирусов и риккетсий, а также др в-ва. Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего испол эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью. Применение. РНГА примен для диагност инф болезней, опред гонадотропного гор­мона в моче при уст беременности, для выявл повыш чувствит к лп, гормонам и в некот др случаях. Механизм. Р-ция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствит и специфич­ностью, чем р-ция агглютинации. Ее испол для идентификации возбуд по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериал продуктов — токси­нов в исслед патологич материале. Соответст испол стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ч антител на поверхн танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исслед материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необход р-цию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами,нагруженными   антителами   разной   групповой   специфичности. Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внеш вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при – р-ции появл осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при + р-кции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.