13. Явление трансформации.

Трансформация – способ передачи генетической информации от клеток-доноров к клеткам-реципиентам с помощью химически чистой ДНК. Явление трансформации кратко освещено при изложении доказательств роли ДНК в наследственности.

В процессе трансформации принимают участие две бактериальные клетки: донор и реципиент. Трансформирующий агент представляет собой часть молекулы ДНК донора, которая внедряется в геном реципиента, изменяя его фенотип. В процессе трансформации клетки донора и реципиента не соприкасаются друг с другом. Механизм переноса генетического материала заключается в том, что из клеток донора выделяются в окружающую среду молекулы или фрагменты молекул ДНК.

Явление трансформации впервые было обнаружено у пневмококков еще в 1928 году Ф.Гриффитсом. Из его опытов следовало, что погибшие от нагрева (60-80°С) клетки вирулентного пневмококка могли передавать свои вирулентные и антигенные свойства живым авирулентным клеткам другого серотипа. Только в 1944 году 0.Звери, К.МакЛеод, М.МакКарти доказали, что это превращение – трансформацию – осуществляет не белок, не полисахарид, а высокополимерная ДНК вирулентного штамма (как было показано позднее, ДНК сохраняет свою двуспиральную структуру и полимерность при описанных условиях тепловой обработки). В 1957 году Л.Лерман и Л.Толмач непосредственно продемонстрировали, что клетки бактерий способны поглощать нативную (двухцепочечную) полимерную молекулу ДНК.

Трансформация в настоящее время воспроизведена на многих видах бактерий, число которых непрерывно умножается, и является основным методом введения векторной ДНК в клетки бактерий при генно-инженерных работах. Для некоторых видов (пневмококков, стрептококков, сенной палочки и гемофильных бактерий) она является естественным способом обмена генетической информацией, выработанным в процессе эволюции. Для других (бактерии кишечной группы) такой способ обмена не происходит в естественных условиях, но его можно воспроизвести в лаборатории. Трансформацию удалось получить не только между бактериями одного вида, но также и между бактериями, принадлежащими к разным видам.

Изучение процессов рекомбинации у бактерий имеет важное значение для ветеринарного врача, так как ведет к пониманию причин высокой изменчивости бактерий, их способности к приобретению свойств патогенности, устойчивости к лекарственным веществам.

Процесс трансформации, начиная с момента добавления ДНК из клеток донорного штамма к культуре реципиента, в общих чертах включает следующие этапы, или стадии:

1. Адсорбцию донорной ДНК на поверхности реципиентной клетки. На этом этапе ДНК чувствителен к ДНКазе.

2. Поглощение донорной ДНК реципиентной клеткой. Причем ДНК может поглощаться только теми клетками, которые находятся в состоянии компетентности. На этой стадии ДНК уже нечувствительна к действию ДНКазы.

3. Образование в реципиентной клетке однонитевых фрагментов донорной ДНК.

4. Синапсис одноцепочечной донорной ДНК с двухцепочечной хромосомой реципиента.

5. Интеграцию части донорной молекулы ДНК в реципиентную ДНК в результате рекомбинации.

6. Репликацию рекомбинантной молекулы ДНК.

7. Экспрессию генов, переданных от донора, т. е. образование рекомбинантов, называемых трансформантами. Количество переносимой при трансформации ДНК составляет около 10 т. п. н. (тысяч пар нуклеотидов).

Трансформация имеет практическое использование:

• для картирования бактериальной хромосомы;

• для конструирования промышленно-полезных штаммов микроорганизмов;

• для введения в геном бактерий определенных маркеров или элиминирования нежелательных мутаций;

• как один из этапов получения трансгенных растений (гибриды с измененным набором генов; изменения производят для придания растению некоторых полезных свойств);

• может выступать в качестве модели в различных генетических и молекулярно-биологических экспериментах на изолированной ДНК.

14. Важное значение для ограничения неблагоприятных последствий генных мутаций имеют естественные антимутационные барьеры. Одним из них является парность хромосом в диплоидных наборах хромосом эукариот, которая препятствует проявлению рецессивных мутаций у гетерозиготных особей. Главным антимутационным барьером рассматривается выработавшая в процессе эволюции способность к репарации наследственного материала. Её сущность - в устранении из наследственного материала клетки изменённого участка.

Различают 3 системы репарации генетического материала: эксцизионная репарация (репарация путём «вырезания»), фоторепарация и пострепликативная репарация.

Механизм эксцизионной репарации заключается в ферментативном разрушении изменённого участка молекулы ДНК с последующим восстановлением на этом отрезке нормальной последовательности нуклеотидов. Такой механизм включает следующие этапы:

а) разрыв спирали ДНК у места повреждения при участии эндонуклеаз;

б) удаление поврежденного участка с запасом в обе стороны с помощью эндонуклеаз;

в) синтез при участии ДНК-полимеразы на месте дефекта нормального участка ДНК;

г) «сшивание» последнего с образовававшимися концами спирали ДНК при помощи фермента ДНК-лигазы (восстановление непрерывности ДНК).

Например, под действием УФ-лучей у человека нарушается комплементарность пар нуклеотидов в двойной спирали ДНК (появляются пары Т-Т, Ц-Ц и т.п.). Они устраняются вышеописанным способом. Однако у различных индивидуумов наблюдаются генетические различия в активности репаративных ферментов и надёжности функционирования механизма ферментативного разрушения изменённого участка молекулы ДНК в целом. У ряда людей наблюдается изменение ДНК и, как следствие, возникновение заболевания «пигментная ксеродерма». В клетках эукариот обнаружены два вида репарации «путём вырезания»:

1) более продолжительная репарация (длительность процесса - от 1 до 24 часов), восстанавливающая большой фрагмент ДНК (около 100 нуклеотидов);

2) быстродействующая репарация (продолжается от 5 минут до 2 часов), восстанавливающая 3-4 нуклеотида.

Пострепликативная(рекомбинационная) репарация «включается» тогда, когда эксцизионная репарация «не справляется» с устранением всех повреждений, возникших в ДНК до её репликации. При репликации во второй спирали ДНК возникают бреши - однонитевые пробелы, соответствующие изменённым нуклеотидам первой спирали. Бреши заполняются участками цепи с нормальной последовательностью нуклеотидов уже в ходе пострешгикативной репарации при участии ДНК-полимеразы.

Фоторепарация заключается в расщеплении ферментом (дезоксирибо-пиримидинфотолиазой), активируемым видимым светом, циклобутановых димеров, возникающих в ДНК под действием ультрафиолетового излучения.

Механизмам репарации свойственны нарушения и «сбои», которые приводят к повышению чистоты мутаций. Известны специфические мутации, блокирующие механизмы репарации и вызывающие наследственные заболевания (пигментная ксеродерма и др.).

Биологическое значение репарации ДНК заключается в резком снижении частоты мутаций, большинство которых оказываются летальными и полулетальными или же снижающими жизнеспособность организмов, вызывающими аномалии и обусловливающими тератогенез. Благодаря репарации ДНК повышается устойчивость генотипа организма к повреждающим агентам (мутагенам).

ФОТОРЕАКТИВАЦИЯ - уменьшение повреждающего действия УФ-излучения на живые клетки при последующем воздействии на них ярким видимым светом. Возникла в процессе эволюции как защитное приспособление от губительного действия УФ-компонента солнечного излучения и является одной из важнейших форм репарации живых организмов от повреждений их генетического аппарата.

S OS – репарация ДНК – это последняя возможность для поврежденной ДНК клетки, которая подошла к репликации, имея повреждения, не устраненные с помощью всех выше перечисленных механизмов репарации. В таком случае клетка может погибнуть, т. к. репликация «застопорится» на первом неустраненном повреждении.

Вместе с тем клетка имеет предназначенный для таких целей крайне рискованный механизм SOS – репарация ДНК, впервые обнаруженный М. Радманом в 1974 году.

В ходе этого механизма индуцируется синтез белков, присоединяющихся к ДНК-полимеразному комплексу и «загрубляющих» его работу таким образом, что подпорченный комплекс становится способным строить дочернюю нить ДНК напротив дефектных звеньев матричной нити, и при этом в дочерней нити появляется много ошибок (мутаций).

В результате SOS – репарации клетка спасается от гибели на этом этапе, и теперь может произойти клеточное деление. ДНК клетки удвоится, хотя и с ошибками и с высоким риском угрозы для последующей жизни клетки.

Основные механизмы развития наследственной патологии связаны с:

1) мутациями, в результате которых возникает,

а) выпадение нормальной наследственной информации,

+б) увеличение объема нормальной наследственной информации,

в) замена нормальной наследственной информации на патологическую;

2) нарушением репарации поврежденной ДНК;

3) стойкими изменениями регуляции генной активности.