2.2. Механизм действия ферментов

Фермент Е обратимо соединяется с субстратом S, образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс ES, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции Р.

Эти представления легли в основу теории «ключ-замок» Э. Фишера (1890). Структура активного центра комплементарна молекулярной структуре субстрата, обеспечивая тем самым высокую специфичность фермента. В образовании фермент-субстратных комплексов участвуют водородные связи, электростатические и гидрофобные взаимодействия, а в ряде случаев также ковалентные, координационные связи.

Д. Кошлендом была разработана теория «индуцированного соответствия» (1958). Пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается в момент их взаимодействия друг с другом, что может быть выражено формулой «перчатка — рука». Субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата пространственную ориентацию. Т.е. фермент только в момент присоединения субстрата будет находиться в активной (напряженной) Т-форме (tensile) в отличие от неактивной R-формы (relaxe).

В настоящее время гипотеза Кошланда постепенно вытесняется гипотезой топохимического соответствия. Сохраняя основные положения теории «индуцированного соответствия», она объясняет специфичность действия ферментов узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе.

Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации.

Энергией активации называется энергия, необходимая для перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при данной температуре.

Как катализируемая ферментом, так и не катализируемая им реакция имеет одинаковую величину стандартного изменения свободной энергии (ΔG). Однако ферментативная реакция имеет более низкую энергию активации. Действуя на скорость реакции, ферменты не изменяют положения равновесия между прямой и обратной реакциями, а лишь ускоряют его наступление.

2.3. Кинетика ферментативных реакций

Ферментативная кинетика исследует влияние химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температура, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Скорость ферментативной реакции (V) измеряют по убыли количества субстрата или приросту продукта за единицу времени.

При ферментном катализе фермент (Е) обратимо соединяется с субстратом (S), образуя нестойкий фермент-субстратный комплекс (ES), который в конце реакции распадается с освобождением фермента (Е) и продуктов реакции (Р):

Важная особенность ферментативных реакций – насыщение фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна его концентрации. При высокой - скорость реакции максимальна, становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [S] и целиком определяется концентрацией фермента (рис. 11).

Рис. 11. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента.

K_S – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ES, обратна константе равновесия:

Чем меньше значение K_S, тем выше сродство фермента к субстрату.

Количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции выражает уравнение Михаэлиса-Ментен:

,

 - скорость реакции, V_max - максимальная скорость ферментативной реакции.

Бриггс и Холдейн усовершенствовали уравнение, введя в него константу Михаэлиса K_M, определяемую экспериментально.

Уравнение Бриггса – Холдейна:

Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимальной (рис. 12). К_m показывает сродство фермента к субстрату; чем меньше ее значение, тем больше сродство.

Экспериментальные значения К_m для большинства ферментативных реакций с участием одного субстрата обычно 10^-2-10^-5 М. Если реакция обратима, то взаимодействие фермента с субстратом прямой реакции характеризуется К_m, отличающейся от таковой для субстрата обратной реакции.

Рис. 12. Графическое определение константы Михаэлиса.