- •Федеральное агентство по образованию
- •СОдержАние
- •I. Теоретическая часть предмет биохимии
- •1. Химия белков
- •1.1. Методы выделения и очистки белков
- •1.2. Функции белков
- •1.3. Аминокислотный состав белков
- •1.4. Структурная организация белков
- •1.5. Физико-химические свойства белков
- •1.6. Классификация белков
- •1.6.1. Простые белки
- •1. Альбумины и глобулины.
- •2. Протамины и гистоны.
- •3. Проламины и глютелины.
- •1.6.2. Сложные белки
- •Структура нуклеиновых кислот
- •Контрольные вопросы
- •2. Ферменты
- •2.1. Химическая природа ферментов
- •2.2. Механизм действия ферментов
- •2.3. Кинетика ферментативных реакций
- •2.4. Свойства ферментов
- •2.5. Регуляция активности ферментов
- •1. Контроль количества фермента.
- •2. Контроль активности фермента.
- •2.2. Химическая модификация фермента
- •2.3. Аллостерическая регуляция
- •2.6. Классификация и номенклатура ферментов
- •2.7. Ферменты в медицине
- •2. Приобретенные энзимопатии.
- •Контрольные вопросы
- •3. Витамины
- •3.1. Жирорастворимые витамины
- •3.2. Водорастворимые витамины
- •Контрольные вопросы
- •4. Основные принципы организации биомембран
- •4.1. Строение и функции мембран
- •1. Фосфолипиды (до 90%) – глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды: фосфатидилхолин
- •Церамид
- •Галактозилцерамид
- •4.2. Транспорт веществ через мембрану
- •2. Облегченная диффузия
- •Контрольные вопросы
- •5. Механизмы передачи гормонального сигнала
- •Трансмембранная передача гормонального сигнала
- •Контрольные вопросы
- •6. Введение в метаболизм
- •6.1. Общая схема катаболизма
- •6.2. Биоэнергетика
- •6.3. Организация и функционирование дыхательной цепи
- •6.4. Разобщение окисления и фосфорилирования
- •6.5. Генерация свободных радикалов в клетке
- •6.6. Реакции общего пути катаболизма
- •6.6.1. Окислительное декарбоксилирование пвк
- •6.6.2. Цикл трикарбоновых кислот
- •Регуляция общего пути катаболизма
- •Контрольные вопросы
- •7. Обмен углеводов
- •7.1. Переваривание углеводов
- •7.2. Обмен гликогена
- •7.3. Гликолиз
- •7.4. Включение фруктозы и галактозы в гликолиз
- •7.5. Челночные механизмы
- •7.6. Цикл кори
- •7.7. Спиртовое брожение
- •7.8. Пентозофосфатный путь превращения глюкозы
- •7.9. Глюконеогенез
- •7.10. Регуляция обмена углеводов
- •Глюкоза → глюкозо-6-фосфат.
- •Пируват → оксалоацетат → фосфоенолпируват
- •7.11. Нарушения углеводного обмена Нарушение гидролиза и всасывания углеводов.
- •Гликогенозы
- •Нарушения промежуточного обмена углеводов
- •Гипер- и гипогликемия
- •Глюкозурия
- •Контрольные вопросы
- •II. Лабораторный практикум Работа 1. Анализ аминокислот и белков
- •1. Качественный анализ аминокислотных смесей методом бумажной хроматографии.
- •2. Цветные реакции на белки.
- •3. Реакции осаждения белков.
- •3. 1. Осаждение белков при нагревании.
- •3.2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
- •3.3. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.
- •3.5. Осаждение белков органическими кислотами.
- •Контрольные вопросы
- •Работа 2. Сложные белки – фосфопротеины и гликопротеины
- •2. Гликопротеины.
- •1.2. Реакция с дифениламином.
- •2.Хромопротеины.
- •2.1. Бензидиновая проба на геминовую группировку гемоглобина.
- •Контрольные вопросы
- •4. Специфичность действия ферментов амилазы и сахаразы.
- •Контрольные вопросы
- •Работа 5. Определение активности ферментов
- •1. Действие активаторов и ингибиторов на α-амилазу слюны.
- •2. Определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту.
- •Контрольные вопросы
- •Работа 6. Витамины
- •9.1. Взаимодействие витамина с с к3[Fe(cn)6].
- •9.2. Реакция с метиленовой синью.
- •Контрольные вопросы
- •Работа 7. Оксидоредуктазы
- •1. Обнаружение дегидрогеназы (ксантиноксидаза, альдегиддегидрогеназа, кф 1.1.3.22) в молоке (реакция Шардингера).
- •2. Сопоставление редокс-потенциалов рибовлавина и метиленового синего.
- •3. Определение каталазы по а.Н. Баху и а.И. Опарину.
- •Контрольные вопросы
- •Работа 8. Обмен углеводов
- •3.1. Реакция Троммера с гидроксидом меди.
- •3.2. Выявление фруктозурии пробой Селиванова.
- •3.3. Энзиматический метод полуколичественного определения глюкозы в моче с помощью тест-полоски "glucophan".
- •Контрольные вопросы
- •Литература
4. Специфичность действия ферментов амилазы и сахаразы.
Специфическими субстратами для амилазы являются полисахариды крахмал и гликоген. Субстратом для фермента сахаразы служит дисахарид сахароза. Протекание гидролиза в присутствии ферментов можно обнаружить по пробе Троммера, которую не дают исходные углеводы.
Нумеруют четыре пробирки. В пробирки 1 и 2 наливают по 2 мл раствора крахмала; в пробирки 3 и 4 - по 2 мл раствора сахарозы. В пробирки 1 и 3 вносят по 0,5 мл раствора слюны, а в пробирки 2 и 4 - по 0,5 мл 1% раствора дрожжевой сахаразы. Перемешивают и ставят на 10 мин в водяную баню с температурой 38-40°С. После охлаждения проводят реакции с йодом на присутствие крахмала в пробах 1 и 2 и пробу Троммера на наличие глюкозы - в пробах 3 и 4. Делают заключение о специфичности изученных ферментов.
Контрольные вопросы
1. Какова роль ферментов в организме?
2. К какому классу химических соединений можно отнести ферменты?
3. К каким классам относятся ферменты, использованные в лабораторной работе?
4. Почему при кипячении растворов ферментов происходит их инактивация?
5. В чем проявляется специфичность ферментов сахаразы и амилазы? Как ее можно доказать?
6. Какое влияние оказывает понижение рН среды и на активность α-амилазы слюны и почему?
7. Какой принцип лежит в основе качественного определения ферментов?
Работа 5. Определение активности ферментов
1. Действие активаторов и ингибиторов на α-амилазу слюны.
В первую пробирку наливают 0,5 мл 1% раствора хлорида натрия, во вторую — 0,5 мл 1% раствора сульфата меди, в третью — 0,5 мл дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют по 1 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 капле разведенной водой слюны (1:5). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, помещают в водяной термостат с температурой 37°С. Через интервалы в 1—2 минуты из пробирок отбирают пробы и проделывают с ними реакцию с раствором йода в йодиде калия. Гидролиз проводят до стадии эритродекстрина. Отмечают время (в минутах) появления эритродекстрина. Делают вывод о действии (активатор, ингибитор) исследованных добавок.
2. Определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту.
Метод основан на установлении предельного разведения раствора α-амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до эритродекстрина. Методом Вольгемута можно пользоваться для приблизительного определения активности α-амилазы в панкреатическом соке, крови, моче и других биологических жидкостях.
1 мл слюны помещают в пробирку, добавляют 9 мл дистиллированной воды и перемешивают. Получается раствор слюны 1:10.
В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую пробирку вносят 1 мл разбавленной в 10 раз слюны и перемешивают путем трехкратного втягивания и выпускания жидкости из пипетки. Затем 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивая содержимое, как указано выше. 1 мл жидкости из второй пробирки переносят в третью и т. д. Из десятой пробирки после перемешивания 1 мл жидкости удаляют.
Во все пробирки, начиная с десятой, добавляют по 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержимое перемешивают. Пробирки помещают в термостат при 37°С на 30 минут.
Через 30 минут пробирки охлаждают и добавляют в каждую по 1 капле раствора йода в йодиде калия. Отмечают пробирку, в которой произошло расщепление крахмала до эритродекстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание. Активность α-амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37°С в течение 30 минут до стадии эритродекстрина.
Пример: если красно-бурая окраска отмечена в четвертой пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз, то 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз раствора крахмала. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при 37°С: 2160 = 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц α-амилазы по Вольгемуту:
А 37°/30' = 320 ед.