спектроскопические методы анализа

Продолжение табл. 3.5

61

Окончание табл. 3.5

Именно по этой причине ИК-спектроскопия используется преимущественно для определения функциональных групп молекулы.

ИК-спектр можно разделить на четыре области:

3600 – 2800 см−1 – область валентных колебаний X-H;

62

2800 – 1800 см−1 – область колебаний тройных связей либо других относительно редких групп;

1800 – 1500 см−1 – область колебаний двойных связей;

ниже 1500 см−1 – область «отпечатков пальцев» (именно эта часть спектра обусловливает уникальность спектра отдельного вещества).

Основные достоинства ИК-спектроскопии применительно к анализу биологически активных веществ:

Молекулярная специфичность метода, что позволяет получать информацию о функциональных группах в молекуле – их типе, взаимодействиях и ориентациях;

Селективность метода по отношению к изомерам, благодаря области «отпечатков пальцев»;

Недеструктивность анализа, даже по отношению к неустойчивым соединениям;

Широкая область рабочих концентраций: от 0,1% до 100%, а также применимость для определения микроколичеств (после соответствующего концентрирования).

Благодаря успехам в развитии спектрального приборостроения, в настоящее время имеются приборы различных конструкций, которые охватывают весь диапазон инфракрасного излучения. По принципу получения спектра приборы для ИК-области можно разделить на две основные группы: диспергирующие (дифракционные) и недиспергирующие (Фурье-спектрометры).

В диспергирующих ИК-спектрометрах роль монохроматора может выполнять призма, либо, в более новых моделях приборов, дифракционная решетка. Обычно в оптической схеме монохроматор располагается после кюветы с анализируемым веществом, т. е. в спектр разлагается излучение, взаимодействовавшее с образцом. При этом последовательно для каждой длины волны излучения регистрируется интенсивность излучения, что и дает спектр поглощения. На пути излучения установлена щель регулируемой ширины, позволяющая выделить для работы определенный спектральный интервал (обычно от 20 до 0,5 см−1).

Наиболее часто используются двухлучевые диспергирующие ИКспектрометры (рис. 3.34). В этом случае излучение источника делится на

63

две части, одна из которых пропускается через анализируемый образец, а вторая – через образец сравнения (чистый растворитель, или таблетка бромида калия без пробы). Эти два пучка попеременно попадают на детектор, где создают сигналы разной интенсивности. Их соотношение дает величину пропускания Т.

Рис. 3.34. Схема диспергирующего ИК-спектрометра:

1 – источник излучения; 2 – система линз; 3 – кювета с образцом и кювета сравнения; 4 – прерыватель (попеременное пропускание одного из лучей); 5, 7 – входная и выходная монохроматические щели; 6 – диспергирующее устройство; 8 – детектор

Основой Фурье-спектрометра является двухлучевой интерферометр Майкельсона (рис. 3.35), в котором оптическая разность хода изменяется за счет движения (сканирования) одного из зеркал в плечах интерферометра. Оптическое излучение от источника проходит через интерферометр, на выходе из него регистрируется интерферограмма, представляющая собой зависимость интенсивности светового потока от оптической разности хода. Спектр, как зависимость интенсивности излучения от волнового числа, получается путем обратного Фурьепреобразования интерферограммы, выполняемого с использованием компьютера.

Фурье-спектрометры значительно выигрывают в фотометрической точности у дифракционных приборов. В дифракционных приборах на приемник поступает свет только в узком спектральном интервале, который попадает на выходную щель монохроматора.

64

Рис. 3.35. Принципиальная схема Фурье-спектрометра:

1 – источник оптического излучения; 2 – линза коллиматора; 3 – кювета с исследуемым веществом; 4 – опорный (эталонный) лазер; 5 – вспомогательные зеркала опорного пучка от лазера; 6 – фотоприемник опорного пучка; 7 – неподвижное зеркало; 8 – подвижное зеркало;

9 – механический привод подвижного зеркала; 10 – объектив фотоприемника; 11 – фотоприемник; 12 – управляющий и обрабатывающий интерферограмму

компьютер; 13 – светоделительная пластина

В Фурье-спектрометрах на фотоприемник всегда поступает весь свет источника (более интенсивный поток), и все спектральные линии регистрируются одновременно. Следовательно, возрастает соотношение сигнал/шум. Фурье-спектрометрия выигрывает также в точности отсчета длины волны. В дифракционных приборах длину волны можно определить только косвенно, а в Фурье-спектрометрах разность хода (и длина волны) определяется непосредственно с помощью лазера. Как следствие, значительно сокращается время записи спектра: спектрометры с преобразованием Фурье дают возможность записать до 50 спектров за секунду, в то время как дисперсионный прибор требует около 20 минут

65

для записи одного спектра. Также улучшается качество спектров и чувствительность анализа (на 2 – 3 порядка) за счет использования режима накопления. Фурье-ИК-спектрометры обычно однолучевые, что делает невозможным запись спектра с образцом сравнения. По этой причине также не удается компенсировать «атмосферные» помехи (наличие углекислого газа и воды), однако этот недостаток устраняется путем записи двух последовательных спектров с вычитанием спектра образца сравнения из спектра анализируемого образца (рис. 3.36).

Рис. 3.36. Сравнение дифракционной и ИК-Фурье спектроскопии

Способы пробоподготовки и методы измерения в ИК-спектроскопии отличаются от тех, которые используются в УФ и видимой области. Это объясняется более высоким молярным поглощением. Необходимые для анализа количества вещества исчисляются в миллиграммах. В случае газов нужна достаточно большая толщина поглощающего слоя, а в случае чистых жидкостей и твердых материалов, напротив, гораздо меньшая, так как плотность поглощающего вещества выше.

Регистрация спектров жидких веществ обычно осуществляется из тонких пленок, расположенных между стеклами из материалов,

66

пропускающих ИК-излучение. Для органических веществ обычно применяется бромид калия. Для водных растворов может применяться селенид цинка, который обладает широким спектральным окном пропускания, однако его высокий коэффициент преломления приводит к появлению полос интерференции, что затрудняет количественное определение. Заменой ему могут служить фторид кальция и фторид бария. Стекла из галогенидов щелочных металлов быстро мутнеют во влажной атмосфере и легко царапаются, но могут быть легко отполированы заново.

Существует три приема для записи спектров жидкостей: в ячейках с фиксированными или съемными спейсерами (прокладками между стекол) либо из пленки непосредственно между стеклами. Для количественных измерений предпочтительно использование фиксированных ячеек, где спейсером служит амальгама, которая обеспечивает постоянный оптический путь. В разборных ячейках эту функцию выполняет прокладка из металлической фольги или тефлона. Стекла в таких ячейках можно разбирать для очистки или изменения длины оптического пути.

Согласно третьему способу, каплю жидкости можно поместить на одно стекло и прижать ее другим. При этом оптический путь регулируется прилагаемым усилием. Это удобно для количественных оценок, но неудобно для летучих веществ. Если образец неустойчив или легко испаряется, для записи спектра можно использовать кюветы с водяным охлаждением.

Также один из приемов для записи спектров жидких веществ – их растворение в подходящем растворителе. Обычно для этой цели не применяют воду, поскольку она несовместима со многими оптическими материалами и сильно поглощает в ИК-области. Лучше всего использовать растворители, состоящие из симметричных молекул, так как они дают минимальное число полос в инфракрасном спектре. Наиболее часто для таких целей используют сероуглерод и четыреххлористый углерод.

Получение спектров твердых веществ требует их предварительного измельчения в мелкий порошок и диспергирования в матрице. В качестве матрицы обычно служит бромид калия: в количестве 200 – 300 мг он смешивается с пробой образца (1 – 2 мг), растирается (для получения качественных спектров желательно, чтобы размер частиц не превышал

67

длины волны излучения), вакуумируется для удаления воды и прессуется ручным гидравлическим прессом (обычно мощностью 15 или 25 т) в небольшую таблетку диаметром 13 мм и толщиной 1 мм. Перед использованием бромид калия можно прогревать до 40°С для того, чтобы на нем не конденсировалась вода, которая даже в минимальном количестве проявляется в спектре в виде полос при 3450 и 1640 см−1. Преимущество такого приема в том, что бромид калия не поглощает в области выше 400 см−1. Также растворимые вещества можно нанести на стекло в виде раствора, после чего удалить растворитель под инфракрасной лампой.

Альтернативным материалом матрицы служит вазелиновое масло. Образец в этом случае готовится растиранием в ступке с несколькими каплями такого масла. Получаемая смесь помещается в разборную кювету, после чего записывается спектр. Примесными сигналами от матрицы являются сигналы CH3- и CH2-групп. Наблюдать сигналы в области 3000 см−1 позволяет матрица из фторированных углеводородов.

Если образец представляет собой тонкий однородный материал, спектр записывают в проходящем ИК-излучении, предварительно закрепив образец в специальном держателе. Он представляет собой пластинку с прямоугольным отверстием, к которому прижимается образец, накрываемый сверху магнитной пластинкой с отверстием в центре.

Регистрация ИК-спектров газообразных веществ требует гораздо более длинных оптических путей, обычно 10 см при достаточно высокой концентрации. В случае следовых концентраций применяются системы с многократным отражением, обеспечивающие оптический путь порядка нескольких метров при небольших размерах прибора. В этом случае предел обнаружения составляет ниже 1 м.д. Особенностью спектроскопии газообразных образцов является проявление вращательного движения молекул, а также уширение спектральных линий вследствие теплового движения и соударения частиц. С данным видом спектроскопии также связан ряд других проблем, например, из-за очень большой длины оптического пути существенную роль начинает играть расходимость светового пучка, из-за чего между центральными и краевыми лучами пучка возникает дополнительная разность хода.

Основные типы кювет для ИК-спектрометров показаны на рис. 3.37.

68

Рис. 3.37. Аксессуары для ИК-Фурье спектроскопии

Направления практического использования метода ИКспектроскопии весьма разнообразны. В области химии и технологии биологически активных веществ этот метод используется:

при установлении структуры новых БАВ, получаемых в ходе органического синтеза или выделяемых из природных объектов (животное

ирастительное сырье, продукты жизнедеятельности микроорганизмов, изучении строения метаболитов);

в фармакопейном анализе при испытании на подлинность лекарственных веществ;

для контроля технологического процесса в промышленном производстве фармпрепаратов, например при определении полноты протекания реакции, анализа исходных веществ и продуктов синтеза;

для количественного анализа БАВ в различных объектах;

в биохимических исследованиях;

в криминалистической экспертизе;

в медицинской диагностике при определении маркерных соединений при различных патологических процессах;

в экологическом мониторинге окружающей среды.

69

В случае исследования новых химических соединений проводят анализ спектра (интерпретацию, расшифровку, объяснение нахождения в спектре определенных полос). Имеющиеся полосы поглощения относят к определенным функциональным группам, связям, фрагментам структур, используя таблицы характеристических частот, имеющиеся в руководствах по ИК-спектроскопии. На основании подобного анализа спектра делают выводы о строении исследуемого вещества.

При расшифровке спектров необходимо учитывать следующие моменты:

а) отсутствие характеристической полосы поглощения является более надежным доказательством отсутствия структурной группы, чем доказательство ее наличия на основании появления полосы поглощения;

б) не все полосы можно интерпретировать; в) выводы, получаемые из спектров, часто остаются более или менее

обоснованными предположениями; точным доказательством ИК-спектры становятся тогда, когда их данные четко согласуются с данными других физико-химических методов анализа (ЯМР, масс-спектры и другие), или в том случае, когда имеются надежные данные для сравнения и спектр идентифицируемого вещества во всех деталях совпадает со спектром проанализированного соединения.

Для структурного ИК-анализа часто рекомендуют следующую схему:

обнаружение функциональных групп (-ОН, -NH2, >NH, -СN, >С=O) и определение класса соединения;

установление типа заместителей в ароматических соединениях;

определение положения и характера двойных связей, влияния стерических факторов.

Полученная таким образом информация в большинстве случаев достаточна для выбора некоторых возможных вариантов.

ИК-спектроскопия в фармацевтическом анализе наиболее широко применяется с целью определения подлинности лекарственных препаратов. Это объясняется большой специфичностью колебательного спектра.

70