спектроскопические методы анализа

который образуется благодаря химической реакции между аминокислотными остатками серина, тирозина и глицина (аминокислоты

65 – 67).

Флуоресцентные наночастицы и нанокластеры. Другая группа флуоресцентных соединений – полупроводниковые нанокристаллы, или квантовые точки. При уменьшении физических размеров частиц полупроводника до нанометровых они начинают проявлять свойства, отличные от объемных полупроводников. В частности, речь идет о квантовых эффектах. При взаимодействии квантовой точки с электромагнитным излучением образуется экситон, который заперт в потенциальной яме. Рекомбинация экситона приводит к высвобождению энергии. Благодаря этому частицы нанометровых размеров, образованные из таких полупроводниковых веществ, как селенид кадмия (CdSe), способны поглощать свет и флуоресцировать.

Из-за различия в химическом строении и природе основного и возбужденного электронного состояния, фотофизические свойства квантовых точек отличаются от свойств органических флуорофоров и флуоресцентных белков. Во-первых, квантовые точки дают узкий и симметричный спектр эмиссии, положение максимума которого зависит от диаметра квантовой точки и материала, из которого она образована. Если варьировать концентрацию реагентов при синтезе, можно добиться формирования квантовых точек преимущественно одного диаметра, которые будут иметь свой специфический цвет флуоресценции. Так, например, для CdSe изменение размера ядра от 13 до 24 нанометров приводит к изменению флуоресценции от голубой (λem = 500 нм) до красной (λem = 610 нм). Важно то, что вид спектра возбуждения флуоресценции не зависит от диаметра; это означает, что можно добиться одновременного возбуждения различных типов квантовых точек, используя лишь одну волну возбуждения, что очень удобно для использования во флуоресцентной микроскопии.

101

Другое преимущество квантовых точек над органическими флуоресцентными красителями – высокие квантовые выходы флуоресценции и высокая устойчивость к фотообесцвечиванию.

В то же время квантовые точки имеют и ряд недостатков. Во-первых, это большие физические размеры, превышающие величину большинства биологических молекул. Во-вторых, материалы, из которых изготавливаются квантовые точки (Cd, Pb, Se, Hg), очень токсичны для живых клеток и организмов. Для уменьшения токсичности применяется многоступенчатый дизайн квантовых точек. Полупроводниковое ядро покрывается двойной защитной оболочкой из родственного материала (для селенида кадмия таким материалом служит сульфид цинка) и гидрофильной полимерной оболочкой, которая увеличивает растворимость квантовой точки в водной среде и дает возможность химически привязывать к поверхности другие молекулы.

Квантовые точки широко используются во флуоресцентной микроскопии и молекулярной диагностике in vitro; также разрабатываются методы для использования их в молекулярном имиджинге и диагностике in vivo.

Кроме квантовых точек, существуют другие флуоресцентные частицы нанометровых размеров. Например, кремниевые наночастицы с ковалентно привязанными к поверхности органическими красителями, которые имеют существенно более низкую токсичность по сравнению с квантовыми точками. Известны также наночастицы, образованные из полимерных органических соединений. Среди других примеров можно назвать золотые и серебряные нанокластеры, синтезированные на матрице с ДНК, которые демонстрируют флуоресцентные свойства и при этом состоят всего из нескольких атомов металла.

102

4. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

4.1. Краткое введение в метод

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или ЯМРспектроскопия – это один из спектроскопических методов исследования химических объектов, основанный на применении явления ядерного магнитного резонанса.

В настоящее время метод ядерного магнитного резонанса, наряду с масс-спектрометрией (МС) и инфракрасной спектроскопией (ИК) – один из наиболее информативных методов исследования молекулярной структуры. Ему посвящено огромное число монографий различного уровня, издается ряд специализированных научных журналов, а в сети Интернет имеется бесчисленное число сайтов с обучающими программами и информацией по многим различным и крайне разнообразным вопросам, связанным с этим методом. Практически во всех научных статьях, посвященных синтезу и выделению новых органических соединений, приводятся данные по различным спектрам ЯМР полученных продуктов. Можно даже признать, что наличие разрешенных ЯМР-спектров для каждого нового или заново получаемого соединения выступает неотъемлемой частью любой научной работы в области современной органической химии, а также в таких смежных областях, как физическая органическая химия, химия природных и высокомолекулярных соединений, а также многих других.

Наиболее востребована для химии и практического использования ЯМР и его приложений спектроскопия на ядрах атомов водорода 1Н, углерода-13 (13C), фтора-19 (19F) и фосфора-31 (31P).

Изучение основ метода ЯМР стало неотъемлемой частью химического образования в высшей школе во многих странах мира, что обусловлено важностью и значением этого метода для создания и поддержания высокого уровня исследований в химических лабораториях.

103

Метод ЯМР продолжает бурно развиваться, и объем информации продолжает по-прежнему стремительно быстро расти, поэтому даже в краткой форме невозможно осветить все аспекты этого метода.

С чисто интеллектуальной точки зрения, один из наиболее удивительных аспектов, касающихся ядерного магнитного резонанса, – это сложность предмета. Эта сложность, обусловленная трудностью восприятия и понимания физической природы явления, часто служит камнем преткновения для желающих понять и использовать методы ЯМР на практике.

Как и с другими физическими техниками, привлекаемыми для исследования химических и биологических систем, ЯМР может применяться просто эмпирически; например, просто для детектирования изменения параметров ЯМР при изменении какой-то экспериментальной переменной. Однако лучшее понимание феномена ЯМР и возможностей его применения часто вознаграждается дополнительным выигрышем в информации о структуре изучаемой системы. Хотя есть некоторый минимальный объем знаний о методе ЯМР, который необходим, чтобы критически читать и осмыслять специальную литературу или планировать и проводить ЯМР-исследования, существует гораздо больший континуум знаний о ЯМР, которыми следует овладеть, чтобы иметь возможность грамотно и корректно применять на практике весь потенциал метода для проведения разнообразных ЯМР экспериментов. В настоящее время с помощью данного метода можно изучать сложные структуры молекул белков и других природных соединений, устанавливать конформацию лабильных соединений в растворе, определять пространственную организацию сложных молекулярных ансамблей, измерять расстояния между отдельными функциональными группами одной молекулы, определять состав и количество молекул и молекулярных комплексов в сложных смесях, а также решать ряд других интересных и важных научных и прикладных задач.

Подобно инфракрасной спектроскопии, ЯМР выявляет информацию о молекулярном строении химических веществ. Однако он обеспечивает более полную информацию, позволяя изучать динамические процессы в образце – определять константы скорости химических реакций, величину

104

энергетических барьеров внутримолекулярного вращения. Эти особенности делают ЯМР-спектроскопию удобным средством, как в теоретической органической химии, так и для анализа биологических объектов. Применение ЯМР в настоящее время включает:

•Магнитно-резонансная томография (МРТ);

•Строение химических соединений:

–Химия природных веществ,

–Органический синтез,

–Строение материалов (твердотельный ЯМР);

• Определение трехмерной структуры:

–Белки и их комплексы,

–Нуклеиновые кислоты,

–Полисахариды;

• Динамические процессы:

–Кинетика реакций,

–Изучение равновесий.

Данный раздел представляет собой только краткое первоначальное введение в явление и метод ЯМР. Будут рассмотрены базовые понятия и процессы, лежащие в его основе, а также основные методики, которые находят сейчас применение в практических целях.

Ядерный магнитный резонанс можно кратко описать следующим образом. Если образец какого-либо химического вещества (необязательно органической природы) находится в магнитном поле и подвергается радиочастотному (РЧ) облучению, то при определенной частоте внешнего облучения ядра атомов в образце могут поглощать энергию. Частота облучения, необходимая для поглощения энергии, определяется тремя параметрами. Во-первых, это тип ядра (например, 1H или 13C). Во-вторых, частота зависит от химического окружения ядра. Например, метильные и гидроксильные протоны метанола поглощают при разных частотах, а амидные протоны двух разных остатков триптофана в нативной конформации белка поглощают при разных частотах, так как они находятся в разном химическом окружении. Частота ЯМР также зависит от пространственного положения в магнитном поле, если это поле не абсолютно однородно. Эта последняя переменная создает основу для таких

105

важных с практической тоски зрения аспектов явления ЯМР, как магнитно-резонансная томография (МРТ) и измерение коэффициентов диффузии. Для измерения коэффициентов диффузии и для визуализации создаются такие экспериментальные условия, чтобы магнитное поле линейно изменялось по всему объему образца. Однако, для большинства спектроскопических целей обычно стремятся создать такие условия, чтобы магнитное поле было как можно более однородным по всему образцу. Требования к однородности поля в ЯМР-спектроскопии довольно жесткие: магнитное поле не должно меняться более, чем на 10 частей на миллиард (parts per billion, ppb) по объему образца. После того, как ядра поглощают энергию, продолжительность и способ, с помощью которого они возвращаются в исходное состояние, испуская и/или рассеивая эту энергию, также могут быть использованы для определения информации о различных динамических процессах, происходящих с молекулами. Чтобы понять, какие именно процессы происходят при поглощении ядрами атомов энергии в магнитном поле и как это используется в ЯМРспектроскопии, необходимо вспомнить физические особенности строения ядра, а также рассмотреть более подробно физическую природу поведения ядер в магнитном поле. Этому и другим важным вопросам и будут посвящены следующие разделы.

4.2.История открытия ЯМР

Ядерный магнитный резонанс – резонансное поглощение или излучение электромагнитной энергии веществом, содержащим ядра с ненулевым спином во внешнем магнитном поле, на частоте ν (называемой частотой ЯМР), обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер.

Явление ядерного магнитного резонанса было впервые обнаружено американским ученым Исидором Раби в 1938 году в молекулярных пучках, за что он был удостоен Нобелевской премии 1944 года.

При этом годом открытия ЯМР в современной научной литературе считается 1945-й, когда американцы Феликс Блох из Стэнфорда и

106

независимо от него Эдвард Миллз Парселл и Роберт Паунд из Гарварда впервые наблюдали сигналы ЯМР на протонах. Феликс Блох и Эдвард Миллз Парселл получили за это открытие Нобелевскую премию по физике в 1952 году. Надо отметить, что открытию ЯМР американскими учеными предшествовало открытие русским физиком из Казанского Университета Евгением Константиновичем Завойским электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

Считается, что Завойский наблюдал сигналы ЯМР в июне 1941 года. Однако в его распоряжении был магнит низкого качества с плохой однородностью поля, результаты были трудно воспроизводимыми и потому так и остались неопубликованными. Так или иначе, но за нашей страной остается приоритет в экспериментальном обнаружении магнитного резонанса. Казанский Университет до сих пор остается одним из ведущих мировых научных центров по изучению магнитного резонанса.

Вслед за ЭПР были открыты другие методы магнитного резонанса: ядерный магнитный резонанс (ЯМР), ферромагнитный резонанс, антиферромагнитный резонанс, ядерный квадрупольный резонанс, многие виды двойных резонансов. Можно сказать, что открытие Завойским ЭПР стало одним из ключевых на пути развития метода ЯМР в нашей стране.

Открытия Е. К. Завойского продолжили его соратники, членыкорреспонденты АН СССР С. А. Альтшулер (Казанский государственный университет) и Б. М. Козырев (Казанский физико-технический институт). Открытие метода ЭПР привело к выдающимся успехам в физике магнитных явлений, физике твердого тела, физике жидкостей, неорганической химии, минералогии, биологии, медицине и других науках.

На основе явления резонансного поглощения сверхвысокочастотного излучения создан, например, квантовый парамагнитный усилитель, использующийся для осуществления дальней космической связи.

107

4.3. Физические основы метода ЯМР. Ядерные спины

Некоторые ядра, будучи помещенными в сильное магнитное поле, способны вступать в резонанс при некоторых характеристических частотах в радиочастотном диапазоне электромагнитного спектра. Небольшие изменения указанной резонансной частоты предоставляют детальную информацию о молекулярной структуре исследуемых соединений.

Чтобы ответить на вопрос, какие ядра можно исследовать методом ЯМР, необходимо вспомнить физические основы современных представлений о строении ядра атома.

Современная модель атома является развитием планетарной модели Бора – Резерфорда. Согласно современной модели, ядро атома состоит из положительно заряженных протонов и не имеющих заряда нейтронов и окружено отрицательно заряженными электронами. Протоны и нейтроны также называют нуклонами. Однако представления квантовой механики не позволяют считать, что электроны движутся вокруг ядра по скольконибудь определенным траекториям (неопределенность координаты электрона в атоме может быть сравнима с размерами самого атома). Основная масса атома сосредоточена в ядре, а массовая доля электронов в общей массе атома незначительна (несколько сотых процента массы ядра). Протоны обладают положительным зарядом и в 1836 раз тяжелее электрона (масса электрона – 9,10938·10 31 кг, масса протона – 1,6726 10−27 кг). Нейтроны не обладают электрическим зарядом и в 1839 раз тяжелее электрона (1,6749 10−27 кг). Нейтроны и протоны имеют сравнимый размер, около 2,5 10−15 м, хотя размеры этих частиц определены плохо.

Электроны атомов – квантовые частицы, как и нуклоны. Их энергия не может изменяться плавно, она изменяется только скачкообразно на некоторые определенные значения. При таком скачке атом переходит из одного энергетического состояния в другое – с одного уровня на другой. Эту энергию перехода (∆Е) можно выразить в соответствии с постулатом Планка уравнением:

где h – постоянная Планка, а ν – частота электромагнитного излучения, которое поглощается или выделяется при переходе.

108

Количество энергетических уровней в атоме фиксировано и определяется квантовыми числами. Есть четыре квантовых числа: n – главное квантовое число, l – орбитальное квантовое число, m – магнитное квантовое число, s – спиновое квантовое число. В атоме есть энергетические уровни электронов, которые отвечают всем возможным наборам квантовых чисел. Все энергетические уровни в атоме не одинаковы по энергии, за исключением уровней, которые отличаются только значением спинового квантового числа. Данные переходы называются вырожденными, т. е. энергия для них одинакова. Таким образом, для электронов атома при его возбуждении электромагнитным излучением можно наблюдать все возможные переходы за исключением тех, которые отвечают изменению спинового квантового числа. Снять вырождение переходов, обусловленное изменением спинового квантового числа, можно, если поместить атом в магнитное поле. В этом случае энергия таких переходов становится неодинаковой и наблюдается появление новых полос поглощения. Это свойство электронов используется в открытом Завойским электронном парамагнитном резонансе, который по своей физической природе весьма близок к ЯМР.

Ядро атома также имеет энергетические уровни. Однако, в отличие от электронов атома, энергетические уровни ядра описываются исключительно спиновым квантовым числом, которое определяется числом нуклонов, входящих в состав ядра. Поэтому в случае, если на ядро атома не действует внешнее магнитное поле, то все энергетические уровни имеют совершенно одинаковую энергию и переходы между ними отсутствуют. Если поместить ядро атома в магнитное поле, то происходит снятие вырожденности уровней. Во внешнем магнитном поле между энергетическими уровнями ядра возникает разница в энергии, что позволяет наблюдать между ними переходы. Чем сильнее внешнее магнитное поле, тем больше разница в энергии уровней и тем легче зафиксировать поглощение энергии при облучении этого ядра электромагнитными волнами подходящей частоты.

Поскольку спиновое квантовое число у различных магнитных ядер может быть неодинаковым, то различается и количество неэквивалентных энергетических уровней, которые образуются в магнитном поле.

109

Вследствие этого вводится понятие спина магнитного ядра. Минимальное значение спинового квантового числа, s, равно 1/2 для таких ядер в магнитном поле возникает только два неэквивалентных уровня (дипольные ядра). Если спиновое квантовое число равно 1, то таких уровней возникает 3 (квадрупольные ядра), если s = 3/2, то возникают 4 уровня и т.д. Наиболее удобны для исследования ядра со спином s = 1/2. К таким ядрам относятся 1Н, 13С, 31Р, 19F.

Возможность регистрации спектров ЯМР основана исключительно на существовании у некоторых ядер ненулевого спина (собственного момента количества движения). Если число нуклонов в ядре четное, то их суммарный спин равен нулю, и такие ядра не дают сигналов ядерного магнитного резонанса. Теперь рассмотрим само понятие спина.

Спин представляет собой чисто квантовую характеристику ядра, однако во многих случаях с целью упрощения рассмотрения основных принципов ЯМР пользуются классической векторной моделью, в рамках которой считают, что при помещении ядра с полуцелым спином в магнитное поле B0 ядерный магнитный момент начинает прецессировать вокруг направления B0 при ориентации оси прецессии либо параллельно, либо антипараллельно B0. При этом частота прецессии зависит от типа ядра, помещенного в магнитное поле, и от индукции магнитного поля:

где ν0 – Ларморова частота; γ – гиромагнитное отношение, которое является характеристичным

для каждого ядра;

B0 – индукция магнитного поля.

Рассмотрим поведение ядра с полуцелым спином (s = 1/2), помещенного в магнитное поле. Наличие спина приводит к существованию двух квантовых состояний, которые часто представляют как соответствующие положению спина, направленного по полю («вверх»,) или против поля («вниз», ) (рис. 4.1).

В отсутствие внешнего магнитного поля эти два состояния вырождены и их заселенности равны. Помещение ядра в магнитное поле

110