спектроскопические методы анализа

Наиболее важная часть спектрометра – магнит, создающий необходимое для метода ЯМР постоянное однородное магнитное поле. В магнит помещается ампула с анализируемым образцом, который, как правило, представляет раствор исследуемого соединения в дейтерированном растворителе. Вокруг ампулы в спектрометре располагается радиочастотный мост, получающий сигнал от передатчика электромагнитного излучения и облучающий анализируемое вещество. Он зачастую используется и для детекции сигнала ЯМР от образца. Далее сигнал передается на усилитель, а с него – на самописец.

CW метод обычно адекватен спектрам чувствительных ядер (1H, 19F, 31P) с I = 1/2, большим магнитным моментом и высоким природным содержанием. При этом были практически невозможны рутинные измерения низкочувствительных, например 13С, а также сильно разбавленных растворов. Кроме того, как и для всех прочих спектрометров подобного типа, каждый эксперимент занимал довольно длительное время, при этом большую часть времени проводилось сканирование области, не содержащей сигналов.

Для спектрометров важнейшей инновацией было создание криомагнитов, в которых за счет явления сверхпроводимости возможно было достичь значительно больших магнитных полей, чем обеспечивали постоянные магниты или электромагниты.

Решающей ступенью было быстрое развитие компьютерной технологии, которое стимулировали в ЯМР пионерские работы Эрнста. Таким образом появилась новая генерация спектрометров и методик –

импульсные методы.

В импульсном методе все ядра одного типа возбуждаются одновременно радиочастотным импульсом. Из чего состоит такой импульс и как он генерируется?

Радиочастотный генератор обычно действует при фиксированной частоте ν1. Однако, если он включается только на очень короткое время τP, получается импульс, который содержит не только частоту ν1, но и протяженную полосу частот, симметрично расположенных вокруг центральной частоты. Однако, только часть частотной полосы эффективна в возбуждении переходов и эта часть примерно пропорциональна τP-1. В

121

ЯМР эксперименте длительность импульса τP порядка нескольких мс. Пример схематичного представления импульса в ЯМР-спеткроскопии представлен на рис. 4.6.

Рис. 4.6. Схематическое представление импульса. Радиочастотный генератор (частота ν1) включается на время от t0 до t1

Простой монохроматический радиочастотный импульс имеет эффективную ширину полосы возбуждения, которая зависит от длительности импульса. Короткий интенсивный импульс возбуждает широкое частотное окно. Длительный слабый импульс дает более селективный профиль возбуждения.

Выбор частоты ν1 определяется В0 и типом ядра. Например, в поле В0 = 4,70 Т для протона требуемая частота генератора 200 МГц, в то время как для резонанса 13С эта частота составляет 50,3 МГц.

Длительность импульса, необходимая для эксперимента, зависит от ширины спектра. Например, если длительность импульса 10-5 с, то ширина частотной полосы 105 Гц.

Амплитуды частот уменьшаются с удалением от несущей частоты. Для того, чтобы все ядра, насколько это возможно, были возбуждены одинаково в эксперименте, требуются очень короткие, или жесткие, импульсы. Длительность импульса выбирается таким образом, чтобы частотная полоса покрывала ширину спектра в 10–100 раз. Уровень мощности обычно составляет несколько ватт (рис. 4.7).

122

Рис. 4.7. Схема обычного одномерного эксперимента

В импульсной спектроскопии, как правило, используется несколько последовательных циклов, что позволяет усилить интенсивность сигналов, повысить чувствительность и получить более разрешенные спектры. Один цикл (или сканирование) состоит из релаксационной задержки (RD) – времени, необходимого для восстановления в системе больцмановского равновесия. Далее следует короткий по времени, но широкий по частотам, жесткий радиочастотный импульс (PW), за которым следует время сканирования (AQ). После его завершения эксперимент можно повторять столько раз, сколько необходимо для данного конкретного образца.

4.7. Практические аспекты применения методов ЯМР-спектроскопии для анализа органических и биологически активных веществ

Что происходит с образцом исследуемого вещества в спектрометре и как создаются ЯМР-спектры? При помещении образца в магнитное поле снимается вырождение спиновых состояний ядер в этом образце. Часть

123

ядер оказывается ориентирована «по полю» (состояние ), а другая часть – «против поля» (состояние ). Разница энергий этих состояний такова, что можно считать, что самопроизвольного перехода не происходит, и распределение ядер по этим состояниям близко к 1:1.

При облучении образца химического вещества электромагнитной волной соответствующей частоты такие переходы будут наблюдаться (явление ЯМР), что физически проявляется в (резонансном) поглощении энергии. Химическая значимость данного явления состоит в том, что ядра в образце находятся в несколько различающихся магнитных полях, что обусловлено экранированием электронными оболочками других ядер (химический сдвиг) либо из-за наличия ядер-соседей с разными спинами, вносящими вклад в локальное магнитное поле (спин-спиновое взаимодействие), и поэтому резонансные частоты спиновых переходов ядер с разным химическим окружением различны. Зависимость количества ядер, в которых происходит резонансный переход, от величины энергии перехода называется спектром ЯМР.

Простейший способ получения спектра ЯМР – помещение образца в постоянное магнитное поле и последовательное облучение всеми частотами, близкими к резонансной для данного типа ядер (эксперимент с непрерывной частотной разверткой, развертка по полю, см. раздел 4.6). Если какие-либо переходы в образце взаимодействовуют с внешним излучением, наблюдается поглощение энергии. Недостаток данного метода состоит в том, что для разрешения двух линий с разницей, например, в 1 Гц, потребуется делать развертку со скоростью не более 1 Гц/с (из принципа неопределенности), следовательно для накопления спектра шириной 1 КГц потребуется более 15 мин. В импульсном методе образец облучается мощным кратковременным импульсом на частоте, близкой к резонансной (чем короче этот импульс, тем большую полосу частот он возбуждает – вследствие принципа неопределенности), а затем в течении некоторого небольшого времени записывается реакция образца (какая именно, будет рассмотрено ниже). В результате получается сумма синусоид, огибающая которой спадает экспоненциально, она называется спадом свободной индукции (ССИ, FID, Free Induction Decay). Зависимость амплитуды от времени или ССИ и спектр ЯМР (зависимость

124

амплитуды от частоты) связаны однозначной математической операцией – преобразованием Фурье, FT, и являются разными представлениями одних и тех же процессов (рис. 4.8).

Рис. 4.8. ССИ до и после преобразования Фурье

Линии в спектре ЯМР всегда имеют конечную ширину (в методе с непрерывной разверткой это связано со скоростью изменения частоты, в импульсном методе – с тем, что в связи с релаксационными процессами, ССИ спадает до нуля через некоторое время, и чем быстрее он спадает, тем шире будут линии в его фурье-образе).

Теперь кратко рассмотрим процессы, происходящие в образце во время импульсного эксперимента. При помещении образца в магнитное поле, собственный магнитный момент каждого ядра начинает прецессировать вокруг оси магнитного поля (ось 0z) наподобие гироскопа с частотой, зависящей от напряженности магнитного поля и типа ядер (рис. 4.9) – ларморовой частотой.

125

Рис. 4.9. Магнитное ядро в магнитном поле, прецессирующее вдоль направления внешнего поля

Проекция этого момента на ось 0z остается постоянной. Фаза прецессии случайна, поэтому суммарная проекция макроскопической намагниченности образца на плоскость 0xy равна нулю, но отлична от нуля на оси 0z, так как в установившемся термическом равновесии более низкий энергетический уровень, соответствующий направлению магнитного момента ядра «по полю», немного более заселен (рис. 4.10).

126

Таким образом в равновесном состоянии макроскопическая намагниченность образца направлена по оси 0z. Далее будем рассматривать намагниченность образца в системе координат, вращающейся вокруг оси 0z с ларморовой частотой (рис. 4.11).

Рис. 4.11. Лабораторная и вращающаяся система координат

В этой системе координат исчезает прецессия магнитных моментов ядер и, следовательно, ее причина (постоянное магнитное поле), а тот самый импульс, который есть ничто иное, как включенное на короткое время переменное магнитное поле, осцилирующее в плоскости 0xy с ларморовой частотой, представляется вектором (B1), направленным по одной из горизонтальных осей вращающейся системы координат.

Итак, когда включено переменное магнитное поле (импульс), два перпендикулярных вектора намагниченности (импульс и намагниченность образца) вызывают появление вращательного момента, который поворачивает вектор намагниченности образца вокруг оси, по которой направлен импульс (естественно, во вращающейся системе координат). Скорость этого поворота зависит от напряженности поля-импульса. Зная эту скорость, можно выключить переменное поле в нужный момент, повернув намагниченность образца на требуемый угол. На основании этого различают -, /2- и т.д. импульсы, рис. 4.12.

127

Рис. 4.12. Виды радиочастотных импульсов

Другое различие может состоять в том, что импульсы бывают широкополосные (поворачивают намагниченность быстро; возбуждают сразу всю полосу частот резонанса каких-либо ядер) и селективные (поворачивают намагниченность медленно; возбуждают лишь какие-то определенные линии в спектре).

Что же происходит после того, как импульс выключен? Если в спектре присутствует только одна линия, попадающая точно в резонанс, то вектор макроскопической намагниченности останется повернутым на тот угол, на который он был повернут, когда выключили импульс (здесь мы пока пренебрегаем явлениями релаксации). Для определенности будем считать, что использовался /2-импульс, «положивший» вектор макроскопической намагниченности в плоскость 0xy (рис. 4.13).

Рис. 4.13. Система после /2-импульса

Поскольку вектор макроскопической намагниченности неподвижен во вращающейся системе координат, в лабораторной системе координат

128

мы будем наблюдать его биения в плоскости 0xy с частотой вращения системы координат. Проекции этих осцилляций на оси 0x и 0y как раз и фиксируются в виде ССИ. Если же есть линии, которые не попадают точно в резонанс (они есть всегда), то соответствующий им вектор макроскопической намагниченности начнет поворачиваться в плоскости 0xy вращающейся системы координат в сторону, зависящую от того, больше или меньше частота резонанса этих линий, чем ларморова (рис.

4.14).

Рис. 4.14. Релаксация системы после /2-импульса

В лабораторной системе координат это отразится на частоте осцилляций соответствующей этим линиям синусоиды в ССИ, и следовательно, на положении линии в спектре ЯМР. Таким образом, для спектра ЯМР с несколькими разными линиями, вектор макроскопической намагниченности разделится на составляющие после его поворота в плоскость 0xy, и каждая из этих составляющих будет вращаться вокруг оси 0z вращающейся системы координат со скоростью, называемой химическим сдвигом данной линии (в первом приближении).

Кроме рассмотренных процессов имеет место постепенное восстановление намагниченности обратно на ось 0z, в результате чего наблюдается экспоненциальный спад ССИ.

129

Разрешение наиболее важно для протонных спектров, а при работе с другими ядрами основной проблемой, как правило, становится чувствительность. Если не требуется решать специальные задачи, съемка спектров ЯМР по малочувствительным ядрам проводится с широкополосной развязкой от области резонанса протонов. Это значит, что одновременно с импульсом, возбуждающим переходы в исследуемых ядрах, генерируется второй импульс на частоте протонов (рис. 4.15).

Рис. 4.15. Схема эксперимента с развязкой по протонам

Этот второй импульс выравнивает заселенности спиновых уровней всех протонов и, следовательно, подавляет спин-спиновое взаимодействие с ними, поэтому мы не наблюдаем спин-спинового расщепления в спектрах по другим ядрам, например, 13С. Кроме этого, облучение протонов инициирует гетероядерный NOE, что также увеличивает интенсивность сигналов.

Второй импульс генерируется устройством, которое называется «декаплер» и может быть как широкополосным, так и селективным. Он может использоваться и для протонных экспериментов – в этом случае возможность облучать образец двумя разными импульсами приводит к целой гамме различных экспериментов.

Рассмотрим следующую импульсную последовательность: /2-t1- /2- AQ(t2), где t1 – переменная задержка (рис. 4. 16).

130