6.6. Моделирование ангиогенеза in vitro

Развитие техники культивирования клеток и тканей вне орга­низма позволило поставить вопрос о моделировании ангиогенеза in vitro. Вначале удалось вырастить в виде тканевой культуры эндотелиальные и гладкомышечные клетки крупных сосудов. В даль­нейшем были выделены ЭК из микрососудов, перициты и другие клеточные компоненты сосудистого русла. Разработаны методы выделения эндотелиоцитов из строго определенных сегментов со­судистого русла с помощью возвратно-поступательной перфузии сосудов взвесью стеклянных шариков, диаметр которых соответст­вует диаметру изучаемого уровня гемоциркуляции (см. 22).

Культивирование ЭК вне организма дает исследователю уни­кальную возможность изучать их поведение в наиболее «чистом» виде, без влияния трудно учитываемых в экспериментах in situ гемодинамических, нейрогуморальных факторов, исключив (или моделируя) взаимодействие между эндотелиоцитами и клетками других типов. Культура ЭК представляет собой уникальную мо­дельную систему для анализа механизмов ангиогенеза.

Образование капиллярных выростов в тканевых культурах че­ловеческого красного мозга впервые описано в 1953 году (437). Эти выросты идентифицировались на третий день после посева, но уже на 10-12-е сутки они подвергались дистрофическим измене­ниям. Вначале ЭК вытягивали небольшие отростки по направле­нию к периферии, затем формировались сплошные клеточные тяжи, которые на поздних стадиях обнаруживали просвет, не со­держащий клеток крови. Сплетения капилляров начинали форми­роваться между 1-м и 5-м днями после начала культивирования. Этот процесс продолжался в течение почти двух недель.

При сокультивировании фрагментов микрососудов с миофибробластами удалось получить образование тяжей ЭК и формирова­ние почек сосудистого роста (369). Колечки аорты, заключенные в коллагеновый и особенно в фибриновый гель и культивируемые в безсывороточной среде, вызывают образование ветвящихся мик­рососудов. Этот ответ блокируется гидрокортизоном и стимулиру­ется средой, кондиционированной клетками карциномы.

Культивирование вывернутых наружу фрагментов аорты под сло­ем внеклеточного матрикса без добавления сыворотки в среду культивирования приводит к образованию на месте эндотелиального пласта капилляроподобных трубчатых структур (303).

Впервые in vitro феномен ангиогенеза на клеточной системе удалось воспроизвести в 1980 году (150): эндотелиоциты микро­сосудов кожи человека формировали трубчатые конструкции в сре­де кондиционированной опухолевыми клетками и клонированными ЭК аорты. Через 20-40 дней после посева в 50% образцов на границе между центром и периферией колонии обра­зовывались капилляроподобные трубки. Клетки имели все характеристики капиллярного эндотелия и росли в отсутствии других клеток (фибробласты, тучные клетки), которые обычно необходи­мы для ангиогенеза in situ. Вначале внутри эндотелиоцита появля­лась цилиндрическая вакуоль, затем вакуоли соседних клеток сливались, образуя трубки, связывающие эти эндотелиоциты. По­сле того, как соединялись 4-5 эндотелиоцитов, появлялась густая сеть капилляроподобных трубочек. Трубки были заполнены час­тично фибриллярным, частично мембранозным, частично аморф­ным материалом, который затем нередко рассасывался. Просвечивающая электронная микроскропия показала, что трубка окружена цитоплазмой эндотелиоцита.

Данные наблюдения свидетельствуют о том, что информация, необходимая для образования капиллярных трубок и всей капил­лярной сети, экспрессируется эндотелиоцитами. Другие клетки для этого не нужны. При обычных условиях культивирования клетки из тех же источников лишь образовывали монослой (149).

Было обнаружено, что если ЭК из вены пупочного канатика че­ловека выращивать на субстрате, покрытом человеческим фибронектином, с добавлением в среду культивирования гипоталамического фактора роста, а в следующих пассажах ли­шить их этих специфических добавок, то через 4-6 недель эндоте­лиоциты образуют трубки, одним концом прикрепленные к субстрату. По времени появление вторичного типа роста обычно совпадает с усилением выработки ЭК простациклина (254).

Формировать трубчатые структуры оказались способными ЭК, выделенные из микрососудов надпочечников, При культивирова­нии эндотелиоцитов микрососудов на коллагене IV-V типа ЭК об­разовывали капилляроподобные трубчатые структуры, имеющие просвет и хорошо организованные межклеточные контакты. При выращивании тех же клеток в трехмерном коллагеновом геле так­же появлялись трубчатые структуры. Для этих целей субконфлюентный слой эндотелия микрососудов, выращиваемый на коллагеновом геле, покрывался еще одним слоем коллагеного геля, после чего происходила ретракция монослоя, приводившая к возникновению сети ветвящихся и анастомозирующих тяжей кле­ток с формирующимся просветом. В просвете обнаруживался кле­точный детрит - субстанция, похожая по структуре на материал БМ(258).

Этот процесс может быть обусловлен тем, что в норме эндотелиоцит биполярен - имеет люминальную поверхноть, контакти­рующую с кровью, и базальную - связанную с внеклеточным матриксом. Очевидно, что взаимодействие коллагена со всей по­верхностью эндотелиоцита вызывает образование новой поверхно­сти, отделенной от коллагенового матрикса (283).

Формирование капилляроподобных трубок зависит от условий культивирования. При выращивании эндотелиоцитов на интерстициальном коллагене они пролиферировали, образовывали мо­нослой, а дискретные трубчатые структуры появлялись довольно поздно. При культивировании эндотелия на коллагене из БМ клетки не пролиферировали, а быстро форм про ваш капилляропо­добные структуры, что сопровождалось интенсивным синтезом внеклеточного матрикса. In vitro удалось сформировать трехмерную, состоящую из сосудоподобных трубок сеть, образованную эндотелиоцитами микрососудов мышечной и жировой ткани. Для этих целей кусочек мышечной или жировой ткани заключался в фибриновый или коллагеновый гель. Через день появлялись ко­роткие эндотелиальные тяжи, которые вырастали из ткани и быст­ро удлинялись. На 5-6-й день в геле образовывать трехмерная сеть анастомозирующих клеточных тяжей, в которых можно было рассмотреть просвет. Эндотелиальные трубки непрерывны. На базальной поверхности выявляется материал, сходный по строению с веществом БМ (284, 288).

В дальнейшем было показано, что процесс ангиогенеза в куль­туре ткани можно инициировать с помощью эфиров форболовой кислоты: при культивировании эндотелия микрососудов на коллагеновом геле и действии на него форболового эфир: ЭК формиру­ют отростки, удлиняются, что сопровождается реорганизацией их цитоскелета (рис.21), и мигрируют в трехмерный коллагеновый матрикс. В дальнейшем они образуют тяжи, которые анастомозируют и канализируются (285, 286). С помощью указанного воз­действия ангиогенез индуцируется и при использовании ЭК крупных сосудов (легочной артерии быка, пупочной вены челове­ка). Культивируемые на коллагеновом геле ЭК после добовления форболового эфира начинают отдавать тяжи в подлежащий коллагеновый матрикс. Эти тяжи ветвятся и анастомозируют. Затем в них также появляется просвет (287, 290, 291).

Добавление в среду культивирования СА (ангиотропина) при­водит к тому, что ЭК, образовавшие конфлюентный монослой, уже через 49-72 часа округляются, разрывают межклеточные контакты и начинают формировать псевдоподии с последующим образова­нием трубчатых структур (188). Без добавления СА этот процесс также имеет место, но проходит очень медленно (258). Конфлюен­тный монослой эндотелиоцитов из аорты быка в этих условиях изменяет свою морфологию с разрывом межклеточных контактов, однако клеточных тяжей при этом не образуется (188). Опухоле­вые СА усиливают пролиферацию и миграцию ЭК микрососудов (но не крупных сосудов). При этом ЭК связывают СА (236).

Если ЭК культивируются на геле, образованном компонентами БМ (матригель), то формирование трубок происходит уже в тече­ние 18 часов (171). В течение первого часа ЭК прикрепляются к матриксу, к концу второго - они выстраиваются в ряды, а через 18 часов образуют трубки с просветом внутри. Антитела к ламинину и энтактину блокируют этот процесс (233).

При выращивании ЭК микрососудов на фибриновом геле до­бавление щелочного ФРФ приводит к формированию капилляр­ных трубок, имеющих широко открытый просвет, однако если одновременно добавить трансформирующий ростовой фактор-бета 1, то формирование просвета ингибировалось и образовывались сплошные тяжи ЭК (324, 325).

Показано, что средний Т-антиген полиомавируса быстро трасформирует ЭК in vivo, что ведет к образованию эндотелиальных опухолей, называемых гемангиомами. In vitro в фибриновом геле такие клетки формируют цистоидные структуры, которые напоми­нают гемангиому, обнаруживают повышенную активность актива­тора плазминогена урокиназнсго типа и сниженную - его ингибитора-1. Добавление в среду культивирования ингибиторов протеаз восстанавливает нормальные морфогенетические свойства этих клеток (289, 325) - ведет к образованию нормальных тубулярных структур. Введение ингибиторов протеаз мышам редуци­руют процесс формирования гемангиом (422).

Ангиогенез in vivo ингибируется радиацией в меньшей степени, чем in vitro. Это обусловлено тем, что ангиогенез in vivo является сложным процессом, в котором участвуют компоненты стромы, естественные СА и ИА. Кроме того, популяция ЭК in vivo более гетерогенна (336).

Итак, при культивировании ЭК они могут как спонтанно, так и при воздействии индукторов ангиогенеза образовывать капилля­роподобные структуры. Однако для нормального морфогенеза ка­пилляров необходим приблизительный баланс между протеазной активностью ЭК и содержанием в них ингибиторов протеаз.