6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

Одноизосновныхтребованийпообеспечениюбиологической безопасности при центрифугировании заразного материала – проведение всех манипуляций в отдельном боксированном помещении в противочумном костюме I типа или оборудование лабораторий боксами ББ III класса. Боксы ББ, соединенные между собой в единую технологическую линию с герметично обработанными соединениями, являются оптимальными в режимном отношении, так как все манипуляции, связанные с опасностью заражения или контаминации (загрузка ротора, центрифугирование, извлечение пробирок и флаконов, проверка их на целостность), проводят в полной изоляции от окружающей среды. К работе с центрифугами допускают только обученный персонал.

Центрифугирование заразного материала рекомендуется проводить в металлических или пластмассовых стаканах, а также пробирках с безопасными завинчивающимися крышками или герметичными пробками. Перед началом работы внутреннюю часть металлических или пластмассовых центрифужных стаканов осматривают на наличие шероховатостей на стенках. Емкости для центрифугирования заполняют материалом на ½ объема и тщательно уравновешивают. При неполной загрузке ротора пробирки размещают симметрично, чтобы обеспечить равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора. После распределения емкостей с заразным материалом в роторе, центрифугу герметично закрывают зажимами и включают. Необходимую скорость центрифугирования устанавливают постепенно.

После окончания работы центрифугу открывают только через 20-30 мин (время, необходимое для полного осаждения аэрозоля). Аккуратно извлекают емко-

57

сти (пробирки, контейнеры) с образцами и просматривают их. При отсутствии повреждений обрабатывают дезраствором только внутреннюю поверхность центрифужной камеры. Продолжительность центрифугирования и характер материала регистрируют в специальном журнале.

3.5. Основные методы изучения биологических свойств микроорганизмов КОН-тест

(Gregеrsen Т., 1978)

Этот тест позволяет отличить грамотрицательные микроорганизмы от грамположительных. В основе метода лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как клеточная стенка грамотрицательных микроорганизмов разрушается при указанном воздействии.

Исследуемую односуточную агаровую культуру суспендируют в капле 3% раствора КОН в чашке Петри. При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, жидкость в капле ста-

новится вязкой, нити слизи тянутсязапетелейна0,5-2см.

Определение типа расщепления глюкозы (OF-тест)

Испытуемую культуру засевают уколом в столбик среды Хью-Лейфсона в двух пробирках. Посевы проводят иглой (или маленькой петлей), не доводя ее до дна пробирки на 5-6 мм. Затем на поверхность среды одной из пробирок наслаивают стерильное вазелиновое масло (0,5-1 мл). Посевы инкубируют при 37 ºС в течение 1-4 сут. Изменение цвета среды в обеих пробирках на желтый свидетельствует о расщеплении глюкозы путем ферментации (F), изменение аналогичного характера только в пробирке, не залитой вазелиновым маслом, - об окислительном процессе (О2), а со-

58

хранение зеленовато-оливкового цвета среды в обеих

пробирках - об отсутствии метаболизма глюкозы.

Определение цитохромоксидазы (Erlich P., 1885)

На поверхность 18-20-часовой агаровой культуры наносят каплю 1% водного раствора пара-диметилфени- лендиамина и добавляют каплю 1% спиртового раствора L-нафтола. При положительной реакции через 1-3 мин появляется ярко-синее окрашивание, обусловленное образованием индофенола синего.

Цитохромоксидазу (по Эрлиху) можно определить также с помощью коммерческого бумажного индика-

тора (СИБ).

Реакция на нитриты

В 1 мл бульона Хоттингера и бульона Хоттингера с 0,1% азотнокислого калия (KN03) засевают петлю агаровой одно-двухсуточной культуры. Бульон должен быть предварительно проверен на отсутствие нитритов реактивом Грисса. Посевы инкубируют при 28°С и через 3 сут в обе пробирки прибавляют по 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях сразу же появляется розовое окрашивание, что указывает на наличие в посевах нитритов. В первом случае они образуются при окислении аммиака через промежуточную стадию нитратов, во втором – впроцессе редук-

ции нитратов.

Посев на комбинированные среды

Посев на комбинированные среды проводят вначале по скошенной части в виде прямой линии, затем в толщу агарового столбика и заканчивают по скошенному агару штрихом. Следует иметь в виду, что укол в толщу агарового столбика не должен достигать дна, с тем, чтобы не нарушать условия для сбраживания глюкозы в относительно анаэробных условиях. Посевы инкубируют при 37 ºС. Результаты учитывают не позднее,

59

чем через 18-24 ч.

Посев на среду Симонса и ацетатную среду

Для посева на эти среды используют минимальную дозу, снимая рост микробов без прикосновения к поверхности среды или предварительно суспендируя петлю культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При положительном результате наблюдают рост на средах и появление синего окрашивания (при использовании бромтимолового индикатора), при отрицательном - отсутствие роста и изменения цвета среды.

2.7. Определение дезаминирования фенилаланина

Среду с фенилаланином засевают массивной дозой штрихом и через сутки инкубации добавляют на поверхность выросшей культуры несколько капель 10% раствора хлорида железа. При дезаминировании фенилаланина наблюдают зеленое окрашивание разной интенсивности, при отрицательной реакции добавленная жидкость и среда имеют желтый цвет.

Определение подвижности бактерий в столбике полужидкого 0,3% агара

Для определения подвижности бактерий делают посев уколом в столбик среды, не доходя до дна про - бирки на 1/3. Подвижные бактерии вызывают помутнение вблизи укола, неподвижные - растут стро-

го по уколу.

Определение индола по Эрлиху

К бульонной культуре (двухили трехсуточной) приливают 1-2 мл эфира. Пробирку встряхивают для извлечения индола, после чего дают эфиру отстояться. К эфирной вытяжке приливают 0,5 мл реактива Эрлиха. При положительном результате эфир окрашивается в красный цвет.

60

ПостановкареакцииФогеса-Проскауэраисметиловым красным

Для постановки этих реакций используют среду Кларка в объеме не менее 5 мл. Посев изучаемой культуры проводят обычной петлей. Инкубируют при 37 ºС. Результаты первоначально учитывают через сутки. Из среды с суточным ростом культуры переносят по 1 мл в 2 пробирки. В одну из них добавляют 1 каплю реактива метиловый красный и следят за изменением окраски - появление красного окрашивания указывает на положительный результат, при отрицательной реакции среда приобретает желтый цвет. Во вторую пробирку для постановки реакции Фогеса-Проскауэра добавляют 0,5 мл 6% спиртового раствора α-нафтола и 0,2 мл 40% раствора КОН. Учет реакции проводят в течение первых 5-10 мин (лучше после встряхивания пробирки) или после 1-2 ч пребывания в термостате при37ºС.При положительной реакции отмечают вишневое окрашивание, при отрицательной - отсутствие окрашивания. В большинстве случаев четкие результаты в указанных реакциях получают через 2-3 сут

инкубации.

Определение чувствительности культуры к диагностическими фагам методом «стерильного пятна»

Дляпостановкипробысфагомиспользуют4-18-часо- вую бульонную культуру. Можно использовать взвесь суточной агаровой культуры в 0,85% растворе натрия хлорида (по оптическому стандарту мутности 10 ед. ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

На поверхность питательного агара тонко оттянутой пастеровской пипеткой наносят капли испытуемой культуры, подсушивают. На одну из капель петлей наносят каплю диагностического фага (опыт), на другую каплю -каплюстерильногоМПБ(контроль).Послеподсушивания

61

чашку инкубируют при 37 ºС в течение 18-20 ч.

При положительном результате на месте нанесения фага появляется четко очерченный лизис (++++), полусливной лизис (+++), большее (++) или меньшее (+) число негативных колоний. При отрицательном результате - на месте нанесения фага и в контроле на-

блюдается сплошной рост культуры.

Определение индофенолоксидазы

Реактивы: 1% водные растворы диметил-пара-фени- лендиамина, тетраметил-пара-фенилендиамина (гидрохлорида), этилоксиэтил-пара-фенилендиамина сернокислого и парааминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) в сочетании с 1% спиртовым раствором a-нафтола или без него.

Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого стекла их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.

Постановка пробы:

а) на поверхность 18-часовой агаровой культуры, подозрительной колонии или полусливного роста на пластинчатом агаре наносят 1 каплю 1% водного раствора одного из указанных реактивов. Положительная реакция на индофенолоксидазу – ярко красная окраска культуры через 20-30 секунд.

б) для постановки пробы на оксидазу можно использовать специальные бумажки из набора СИБ или пропитать помещенную в чашку Петри полоску фильтровальной бумаги 2-3 каплями 1% водного раствора одного из реактивов. Культуру наносят на полоску смоченной реактивом бумаги платиновой петлей (но не хромникелевой), стеклянной или деревянной па-

62

лочкой и распределяют в виде небольшого пятнышка. Через 10-30 секунд появляется пурпурно-красное окрашивание, свидетельствующее о положительной реакции.

Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на индофенолоксидазу дают вибрионы, аэромонады, псевдомонады, плезиомонады, а отрицательную

– все энтеробактерии.

Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах.

Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах, пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными контролями соответственно с культурами вибрионов или псевдомонад и энтеробактерий, выращенными на используемом в лаборатории пита-

тельном агаре.

Проба тяжа (String test)

На чашку Петри наносят каплю 0,5% водного раствора дезоксихолата натрия или 2,5% водного раствора моющего средства «Прогресс» и в ней суспендируют 18-часовую агаровую культуру исследуемого штамма. При положительной реакции суспензия немедленно теряет мутность, становиться слизистой и вязкой – тянется за петлей, что характерно для вибрионов.

Проба позволяет дифференцировать вибрионы не только от энтеробактерий, но и от других родственных грамотрицательных микроорганизмов, которые не образуют «тяжа». Исключение составляют лишь некоторые штаммы аэромонас, которые в течение при-

мерно 60 секунд образуют слабо тянущуюся нить.

Определение декарбоксилазной активности

63

Определение декарбоксилазной активности проводят на специальных средах Мёллера, Фалькоу, Бир- гер-Крушинской, Ряпис и др. В пробирки с лизином, орнитином, аргинином и контролем (среда без аминокислоты) засевают по полной бактериологической петле 18-часовой агаровой культуры и заливают 0,5-1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37±0,5°С. Учет результатов производят ежедневно, при отрицательном результате – до 1-4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую сторону, а в дальнейшем при декарбоксилировании аминокислот накапливаются амины и происходит защелачивание среды.

Среда Мёллера фиолетового цвета, при кислой реакции желтеет, щелочной - изменяется до красно-фиоле- тового цвета. Среда Фалькоу имеет травянисто-зеле- ный цвет, при кислой реакции желтеет, при щелочной - синеет. Среда Биргер-Крушинской при положительной реакции изменяется в синий цвет, среда Ряпис и

др. меняется от оранжевого до сиреневого.

Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов

(глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.

Для посева используют культуру, выращенную в течение 12-20 ч на плотной или 3-4 часа в жидкой питательной средах. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при 37±0,5°С и учитывают через 6-18 ч. Для определения диастатической активности могут быть использованы среда Гисса с крахмалом и среда Кодама. Культуру засевают в среду и также инкубируют при 37±0,5°С. Через 18 ч в пробирку со средой Кодама добавляют 2-3 капли раствора Люголя. При

64

разложении крахмала среда не окрашивается. Определение протеолитических свойств В столбик желатины уколом засевают 18-часовую

культуру и инкубируют в течение 2-3 суток при температуре 37±0,5°С в течение 18 ч. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на 20 мин. При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в контрольной пробирке) - затвердевает.

Определение образования индола

Холерные вибрионы при выращивании в средах, содержащих триптофан (пептонная вода, мясо-пептон- ный бульон, бульон Хоттингера и др.), расщепляют его с образование индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек или реактива Эрлиха.

Определение уреазной активности на среде Кристенсена 18-20-часовую агаровую культуру засевают петлей на скошенную поверхность среды. Ферментацию мочевины определяют по изменению цвета среды от желтого к красно-фиолетовому в течение 1-2 суток.

Определение лецитиназной активности Бульонную или агаровую 18-часовую культуру в

виде бляшки засевают на специально приготовленный агар, содержащий эмульсию куриного желтка. Посев инкубируют при 37±0,5°С. О лецитиназной активности судят по зоне преципитации и полного просветления вокруг засеянных участков среды (в мм).

Выявление способности к биолюминесценции Изучаемые штаммы засевают в 1% пептонную воду или на пластинки щелочного агара, инкубируют при температуре 37±0,5°С в течение 18 ч. Выросшие культуры просматривают в темной комнате. Свечение наблюдают после 5-10 мин адаптации в темноте.

65

3.6. Обеззараживание исследуемого материала при постановке ПЦР

Использование ПЦР-анализа в практике лабораторной диагностики возбудителей I-II групп патогенности должно проводиться в строгом соответствии с СП 1.3.1285-03 и действующими нормативными документами. Одно из основных противоэпидемических требований при постановке ПЦР – обеспечить надежную инактивацию исследуемого материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний. Однако применяемые в работе с возбудителями особо опасных инфекций табельные средства обеззараживания (растворы перекиси водорода, хлорамина, формалина и др.) не могут быть использованы в данном случае из-за их повреждающего действия на ДНК или ингибирования ПЦР.

Внастоящеевремяразработаныспособыобеззараживания исследуемого материала, зараженного или подозрительного на зараженность бактериями I-II групп патогенности, при проведении генодиагностических исследований методом ПЦР.

Согласно методическим указаниям (МУ 3.5.5.103401) отобранные для ПЦР пробы (суспензии органов, кровь, биологические жидкости, смывы с поверхностей, фильтраты почвы, взвеси бактериальных культур) инактивируют следующими способами:

1. Материал, зараженный или подозрительный на зараженность неспорообразующими бактериями I-II групп патогенности.

Впробу вносят проверенный на бактерицидное действие мертиолат натрия до концентрации 1:10 000 и прогревают при 56°С в течение 30 минут. Затем 100 мкл обработанного метриолатом натрия материала переносят в микроцентрифужные пробирки типа эппен-

66