6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

черным гало (S. paratyphi A, S. cho-leraesuis, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum образуют светлые зеленоватые колонии), среда под колониями также окрашена в черный цвет. Следует помнить, что компоненты висмут-сульфитного агара ингибируют рост возбудителябрюшноготифа.Сальмонеллымогутформировать также переходные и шероховатые тусклые и сухие R-колонии с неровными краями.

Сальмонеллы отличаются от E. coli меньшей ферментативной активностью. При ферментации глюкозы и ряда других углеводов образуют кислоту и газ (за исключением S. typhi и некоторых других серотипов), обладают лизин- и орнитиндекарбоксилазами, не имеют фенилаланиндезаминазы, растут на голодном агаре с цитратом (кроме S. typhi), не фер-

ментируют лактозу (кроме S. arizonae, S. diarizonae),

не образуют индола, не имеют уреазы, дают отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра.

Антигены. Сальмонеллы содержат О- (соматиче - ские), Н- (жгутиковые) и некоторые - К- (капсульный) антигены. Н-антигены могут существовать в двух разных фазах: специфической 1-й фазе и менее специфической, или групповой, 2-й фазе. Анализ антигенного строения является обязательным элементом микробиологической диагностики сальмонеллезов и проводится по схеме Ф. Кауфмана и П. Уайта, в основу которой положена общность О-антигена сальмонелл, объединенных в серологические группы: A, B, C, D, E, F и т.д. Всего известно около 65 серогрупп, в которых О-антигены обозначены цифрами. В сокращенном варианте эта схема представлена в таблице 11.

207

Таблица 11 Классификация сальмонелл по антигенной структуре

(в сокращенном варианте)

К факторам вирулентности S. typhi относится Viантиген, представляющий собой капсульный полисахарид, защищающий микроб от фагоцитоза и комплемента. У подавляющего большинства других

208

сальмонелл Vi-антиген отсутствует.

Определение сероварианта сальмонелл (серологическая идентификация) по схеме Кауфмана-Уайта Выделенную культуру исследуют в ориентировочной реакции агглютинации на стекле с сальмонеллезной поливалентной сывороткой ABCDE. При положительном результате переходят к расшифровке сероварианта. Определение антигенной структуры начинают с выявления О-антигена. На крышку от чашки Петри наносят пастеровскими пипетками капли сывороток, содержащих антитела против основных соматических антигенов 2, 4, 6, 9 групп А, В, С, D, соответственно. Если с одной из сывороток наступит агглютинация (например, 0-4), дальнейшее определение вида осуществляют сыворотками против жгутиковых антигенов (Н) в специфической фазе в пределах установленной группы (0-4 группы В). Для агглютинации О-сы-вороткой следует брать верхнюю часть выросшей культуры на скошенном агаре, а для агглютинации Н-сыворотками – из конденсата или из самой нижней части роста. После установления принадлежности культуры к тому или иному виду определяют полную структуру О-антигенов и Н-антигена и таким образом устанавливают антигенную формулу (серовар) выделенной культуры. При отсутствии реакции агглютинации с поливалентной адсорбированной О-сывороткой к сальмонеллам групп ABCDE культуру испытывают с поливалентной сывороткой, включающей антитела к антигенам сальмонелл редких групп.

Лабораторная диагностика. Основу лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых сальмонеллами, выявления носительства, изучения обсемененности объектов окружающей среды, инфицированности пищевых продуктов составляет бактериологическое ис-

209

следование материала по стандартной схеме.

При проведении лабораторной диагностики тифопаратифозных заболеваний учитывают патогенетические особенности этих инфекций, связанные с локализацией возбудителя в лимфоидной ткани внутренних органов, крови, желчи и выделением его с испражнениями и мочой. В первые дни заболевания выделяют гемокультуру путем посева крови в соотношении 1:10 в жидкие питательные среды, например, желчную среду Рапопорт. Накопительные среды с желчью являются элективными для возбудителей тифо-паратифозных заболеваний. Другие бактерии на них не растут или рост их замедлен. Желчь препятствует свертыванию крови, нейтрализует нормальные антитела сыворотки, разрушает комплемент и тем самым снижает бактерицидные свойства крови при сохранении ее питательных свойств, а также препятствует действию бактериофага. Результаты посевов крови на среде Рапопорт учитывают через 18-24 ч, изучают характер роста. При брюшном тифе среда Рапопорт окрашивается в красныйцветвследствиеферментацииглюкозы,при паратифах А и В дополнительно выявляют газообразование. При отсутствии роста на среде Рапопорт посевы продолжают инкубировать и просматривают через 48, 72 ч, на 5-е и 10-е сутки. При наличии роста, после проверки на однородность выросшей культуры микроскопией окрашенного по Граму мазка, делают высев на дифференциально-диагностиче- ские среды. На 2-ой неделе заболевания выделяют копроили уринокультуру после посева фекалий и мочи на обогатительные и дифференциально-диа- гностические среды. Выделенную культуру идентифицируют по биохимическим и антигенным свой-

210

ствам. Из крови часто высевается брюшнотифозная культура, содержащая Vi-антиген, которая не агглютинируется О-сывороткой, т.к. Vi-антиген препятствует такой агглютинации. Если выделенный штамм не агглютинируется или агглютинируется не до диагностического (менее ½) титра, ставят реакцию агглютинации на стекле с Vi-сы-вороткой. Все культуры S. typhi фаготипируют с помощью набора Vi-фагов. Определяют чувствительность патогена к антибактериальным препаратам.

Для диагностики гастроэнтероколитов, возникающих в результате пищевых токсикоинфекций, для анализа отбирают испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, мочу, дуоденальное содержимое, секционный материал. Дополнительными объектами исследования являются остатки пищи, употреблявшейся заболевшими, исходные продукты и полуфабрикаты, корма животного и растительного происхождения, смывы с различного оборудования и предметов, предполагаемых в качестве фактора передачи возбудителя.

Окончательный диагноз пищевой токсикоинфекции устанавливают только после выделения возбудителя из организма больных людей и пищевых продуктов, его идентификации с установлением вида и серовара или биовара. Определение серовара проводят с помощью монорецепторных сывороток. Наиболее часто при токсикоинфекциях выявляют серовары S. typhimurium, S. enteritidis, S. anatum.

Возбудителем внутрибольничного сальмонеллеза чаще всего является S. typhimurium, которая может встречаться в виде трех биоваров, одинаковых по антигенной структуре, но различающихся по патогенности для белых мышей при энтеральном заражении и

211

по чувствительности к антибиотикам. Однако нередки заболевания, вызываемые S. derby, S. heidelberg, S. wien, S. haifa и др., которые относятся к группе В. Эти сальмонеллы по своим морфологическим, физиологическим и антигенным признакам не отличаются от возбудителей пищевых токсикоинфекций.

Как правило, сальмонеллы, выделяемые при внутрибольничной инфекции, резистентны к 15-20 антибиотикам. Это связано с наличием у них конъюгативных R-плазмид, несущих множественную устойчивость к антибиотикам. Лабораторная диагностика внутрибольничных сальмонеллезов осуществляется по общепринятой схеме.

Серологические исследования. Серологическую диагностику брюшного тифа и паратифов, выявление и дифференциацию различных форм носительства проводят постановкой реакции агглютинации Видаля с О- и Н-диагностикумами. Основное диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. Н-антитела появляются позже О-антител и сохраняются после болезни или прививки более длительное время. Положительная реакция Видаля только с Н-диагностикумом указывает либо на ранее перенесенное заболевание (анамнестическая реакция) либо появляется в результате вакцинации (прививочная реакция). Диагностический титр с О-антигеном - 1:200. Большое значение для диагностики имеет нарастание титров в течение болезни.

Постановка реакции Видаля Реакцию ставят с О-монодиагностикумом и Н-тифоз-

ными, Н-паратифа А и Н-паратифа В. На каждый диагностикум готовят ряд разведений испытуемой сыворотки. Контроль сыворотки – один для всех диагностикумов (таб.12).

212

Таблица 12

Постановка реакции Видаля

РНГА чувствительна и специфична с эритроцитарными О- и Vi-диагностикумами. Диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. антитела к Vi-антигену невысоки. Vi-антитела после полного выздоровления быстро исчезают, но при наличии брюшнотифозного носительства они присутствуют постоянно. В связи с этим РНГА с эритроцитарным Vi- диагно-стикумом применяется для выявления бактерионосительства.

Эффективным способом экспресс-диагностики сальмонеллезных и некоторых других болезней являются экспресс-тесты. Определение патогенных микроорганизмов с помощью Singlepath-тестов производства фирмы Merck (Германия) основано на методе визуальной иммунохроматографии (разновидность иммуноферментного анализа).

Singlepath-тест Salmonella представляет собой диагностическую панель с лункой для добавления обогащенного образца, тестовой (Т) и контрольной (С) зонами. Антигены определяемых в образце бактерий взаимодействуют с меченными золотом антителами, включенными в состав теста, с образованием окрашенного комплекса антиген-антитело. Окрашенный комплекссвязываетсясиммобилизованнымиантителамис образованием линий в тестовом и контрольном окнах.

213

Схема выявления сальмонелл из образцов продуктов:

1.Неселективное обогащение на забуференной пептонной во-де (25 г образца + 225мл BPW) при 37°С в течение 18-24 ч.

2.Селективное обогащение на среде RVS - RappaportVassiliadis (магниевая среда). 0,1 мл культуральной жидкости добавляют к 9,9 мл RVS среды. Инкубируют при 41°С 18-24 ч.

3.Инактивация. 2 мл культуральной жидкости прогревают на водяной бане при 100°С в течение 15 мин.

4.Singlepath-тест. В лунку диагностической панели вносят 160 мкл инактивированной культуральной жидкости. Результаты учитывают визуально в тестовой и контрольной зонах через 20 мин.

5.Подтверждение. Высев положительных результатов

на дифференциально-диагностические среды РАМ- БАХ-агар, XLD-агар или висмут-сульфитный агар. Преимущества метода:

•Экспрессность. Результат через 20 мин.

•Надежность. Высокая чувствительность и специфичность метода (99%). Ясный и четкий положительный или отрицательный результат. Встроенный положительный контроль.

•Легко использовать. Нет необходимости в ходе исследов­ ания добавлять какие-либо реагенты. Все компоненты включены в одну тест-пластинку. Отсутствуют сложные этапы в исследовании. Одноэтапный формат теста исключает возможные ошибки.

•Удобный. Необходимо добавить образец и учесть результат.

•Экономичный. Сокращает время исследования, снижает трудозатраты, уменьшает количество пересевов.

•Нет необходимости приобретать и обслуживать до-

214

рогостоящее оборудование.

Singlepath-тест одобрен Федеральным Центром Госсанэпиднадзора РФ (МР №24ФЦ/976) и разрешен к применению в лабораториях санитарно-эпидемиологиче- ской службы, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в производственных лабораториях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие 1.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia,

Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morga-nella, Proteus, Yersinia,

Edwardsiella)

•Изучение морфологии роста на скошенном агаре.

•Изучение морфологии микробов в мазках, окрашенных по Граму.

•Постановка пробы Gregersen с 3% КОН.

•Посев полученной культуры на среду Клиглера, в среды минимального дифференцирующего ряда, на ско-

шенный МПА, среды Эндо, Плоскирева, ЭМС, ВСА.

Примечания:

-при посеве на пластинчатые среды получить рост изолированных колоний;

-здесьивдальнейшемпосевыинкубировать18-24чпри37°С;

-посевы в среду Кларка и полужидкий агар дублировать и инкубировать при 37 и 22°С.

Занятие 2.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Entero- bacter,Hafnia,Serratia,Morga-nella,Proteus,Yersinia,

215

Edwardsiella)

•Изучение морфологии колоний на дифференциаль- но-диагностических средах.

•Изучение морфологии роста культуры в бульоне.

•Подготовка мазков из бульонной и агаровой культур, окрашивание их по Граму.

•Учет результатов роста культуры на среде Клиглера и в средах минимального дифференцирующего ряда.

•При необходимости проведение предварительной серологической диагностики испытуемой культуры.

•Предварительное заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.

Примечание: при отрицательном результате реакции Фогеса-Проскауэра посевы на среде Кларка инкубировать еще 18-24 ч.

Занятие 3.

Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia,

Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morga-nella, Proteus, Yersinia,

Edwardsiella).

•Изучение морфологии 2-суточного роста культур на висмут-сульфитном агаре.

•Учет результатов роста в средах минимального дифференцирующего ряда через 48 ч.

•Постановка реакции с метиловым красным и Фоге- са-Проскауэра.

•Заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.

Занятие 4. Бактериологический диагноз эшерихиозов

216