6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

227

метод серийных разделений в агаре. При определении чувствительности к этому антибиотику как методом серийных разведений в агаре, так и ДДМ, в питательную среду необходимо вносить 25 мг/л глюкозо-6-фос-фата.

7.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ

7.1.Биологические свойства холерных вибрионов

Холера – особо опасная инфекционная болезнь, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, водным, пищевым и контак- тно-бытовым путями распространения инфекции.

Холерные вибрионы относятся к сем. Vibrionaceae, роду Vibrio, виду Vibrio cholerae, который включает как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные к эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие в воде вибрионы, безопасные для человека или обусловливающие спорадические случаи диарей и инфекций с внекишечной локализацией возбудителя.

Холерные вибрионы грамотрицательные, аспорогенные полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки, варьирующие в размерах (0,2-0,6 мкм в ширину и 1,5-3,0 мкм в длину), с одним полярно расположен-

228

ным жгутиком, благодаря которому очень подвижны. Холерные вибрионы хорошо растут на щелочных питательных средах pH 7,6-8,6, содержащих до 2% NaCl. Оптимальная температура выращивания - 35-38 ºC. На щелочных жидких питательных средах - мясо-пептон- ном бульоне (МПБ) и 1% пептонной воде (ПВ) - через 6-8 ч инкубирования при 37 ºC наблюдается образование нежной пленки на поверхности и легкое помутнение среды. На пластинках щелочного мясо-петонного агара (МПА) холерные вибрионы в типичной S-форме через 18-24 ч выращивания образуют гладкие, прозрачные, влажные с ровным краем колонии, диаметром 2-3 мм. Могут встречаться атипичные колонии

– шероховатые, мутные, пигментированные (коричневые или желтые), коккоподобные. На элективной среде TCBS на зеленом фоне среды колонии вибрионов круглые, гладкие с ровным краем, плоские, желтого цвета. При более длительной инкубации желтый цвет колоний часто переходит в зеленый цвет.

Холерные вибрионы, как и другие представители рода Vibrio, продуцируют индофенолоксидазу, ферментируют до кислоты без газа глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, декарбоксилируют лизин и орнитин, не обладают дигидролазой аргинина. Холерные вибрионы относятся к 1 ферментативной группе по Хейбергу: расщепляют до кислоты сахарозу и маннозу и не разлагают арабинозу. Отношение к лактозе непостоянное. Вибрионы разжижают желатину, казеин, фибрин; вырабатывают лецитиназу, липазу, нейраминидазу, хитиназу, пенициллиназу.

V.cholerae по наличию специфического O-антигена распределяются на серологические группы, их более 200. Возбудителями холеры являются холерные вибрионы O1 и O139 серологических групп. Холерные

229

вибрионы других не O1/не O139 серологических групп могут вызывать спорадические или групповые случаи диарей, не склонные к эпидемическому распространению.

Холерные вибрионы, относящиеся к О1 серогруппе делятся на три серовара - Огава, Инаба, Гикошима. Принадлежность культур к V. cholerae О1 серогруппе устанавливают по результам агглютинации видоспецифической холерной сывороткой О1. Вариантоспецифические холерные сыворотки Огава и Инаба позволяют определить соответственно серовар культуры. Холерные вибрионы, реагирующие в одинаковых титрах с сыворотками обоих вариантов – Инаба и Огава, относятся к серовару Гикошима. Типичные штаммы холерных вибрионов в S-форме агглютинируются видо- и вариантоспецифической сывороткой не меньше, чем до 1/2 титра. Культуры в R-форме взаимодействуют с холерной RO-сывороткой, при этом агглютинация с видоспецифической холерной сывороткой О1 серогруппы снижена или отсутствует совсем.

Холерные вибрионы в пределах O1 серогруппы делятся на два биовара: классический и эльтор, имеющие существенные фенотипические и генетические отличия. При выделении атипичных культур проводят дополнительные исследования. Штаммы, агглютинирующиеся диагностическими сыворотками О1, RО, Инаба (Огава) ниже 1/2 титра или агглютинирующиеся только RО сывороткой, с полной или частичной утратой способности лизироваться диагностическими холерными бактериофагами, изучают в тестах, определяющих их принадлежность к роду Vibrio (табл. 14). Слабоагглютинирующиеся холерной О1 сывороткой и фагорезистентные культуры исследуют также в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), флюорес-

230

центно-серологическим методом (МФА), реакцией иммобилизации вибрионов (РИВ) или адсорбцией по Кастеллани. Культуру, агглютинирующуюся сывороткой О139, относят к холерным вибрионам О139 серогруппы. Если культура не агглютинируется холерными сыворотками О1, О139, но по совокупности признаков относится к виду холерных вибрионов, ее изучают в реакции агглютинации с набором диагностических холерныхсыворотокО2-О83серогрупппоотечествен- ной классификации. Кроме того, штаммы V. cholerae не О1/О139 серогрупп типируют бактериофагами диагностическими холерными ТЭПВ 1-7. Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1 группы относятся преимущественно к О2, О5, О6, О8, О9, О14, О17, О22, О24, О28, О34, О36, О41, О42, О47, О5О серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

Таблица 14

Основные дифференциальные признаки рода Vibrio и некоторых других микроорганизмов

231

–бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-ди- изопропил-птериоидин; Х - нет данных;

+ - положительный результат в 90%;

–- отрицательный результат в 90%;

+/– - положительный и отрицательный результаты встречаются в равной степени; +(–) или –(+) - в скобках редко наблюдается результат.

Основными признаками дифференциации биоваров холерных вибрионов являются проба с холерными диагностическими фагами классическим и эльтор, реакция агглютинации с эритроцитами цыпленка или морской свинки, тест на чувствительность к 50 ед/мл полимиксина и образование ацетилметилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра (табл. 15).

Таблица 15 Дифференциальные признаки биоваров V. cholerae О1

232

Условные обозначения см. в таблице 14.

Холерные вибрионы являются носителями умеренных фагов с низкой литической активностью. Известны фаги, активные в отношении холерных вибрионов O1 и не O1, включая O139 серологическую группу, а также с более узким спектром литического действия, в пределах отдельных групп штаммов, например ctx+ и ctx¯ холерных вибрионов.

Одним из основных факторов вирулентности (и эпидемической значимости) холерных вибрионов, определяющих тяжесть клинической картины при холере, является холерный энтеротоксин, синтез которого контролируется кластером генов ctxAB.

Понятие эпидемической значимости базируется на определении комплекса показателей:

-прямые - выявление гена холерного токсина в ПЦР и определение активности его продукции на кроли- ках-сосунках;

-косвенные - отсутствие гемолитической, липазной активности, поздняя ферментация маннита, высо-

кая адгезивная активность in vitro (на модели эритроцитов).

Холерные вибрионы имеют две хромосомы: большую размером 2 960 т.п.н. и малую размером 1 070 т.п.н.. На большой хромосоме V. cholerae расположены гены патогенности: ctxAB, кодирующий биосинтез CT, гены, определяющие продукцию дополнительных

233

холерных токсинов, гены tcpA-F, кодирующие продукцию TCP, а также гены, необходимые для репликации, транскрипции,репарацииДНК,биосинтезаклеточной стенки и O-антигена. Биосинтез O1 антигена определяет кластер генов, обозначенный как wbe. Продукция O139 антигена кодируется кластером генов, также локализованном на большой хромосоме и имеющим обозначение wbf. Выявление с помощью ПЦР генов wbe и wbf, специфичных для холерных вибрионов O1 и O139 серологических групп, позволяет определить серогруппу возбудителя холеры. На малой хромосоме, помимо генов с неустановленной функцией, локализованы структурные гены hlyA, отвечающие за синтез термолабильного гемолизина, а также остров интегронов, содержащий гены, кодирующие антибиотикоустойчивость, и участвующий в приобретении новых генов. Следует отметить, что ген hlyA присутствует в хромосоме всех штаммов V. cholerae, как способных к биосинтезу термолабильного гемолизина, так и не продуцирующих этот белок. Однако в гене hlyA холерных вибрионов классического биовара, в отличие от такового V. cholerae эльтор, имеется делеция протяженностью 11 п.н., вследствие чего продукция гемолизина вибрионами этого биовара невозможна.

Штаммы холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, содержащие гены ctxAB и tcpA-F, вызывают холеру и являются эпидзначимыми. Эти штаммы не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Эпидемически не значимые штаммы холерных вибрионов, не содержащие генов ctxAB и tcpA-F, лизируют эритроциты барана в пробе Грейга. Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина) ctxAB варианты холерных вибрионов O1, также как и других серогрупп могут вызывать спорадические (единичные) или групповые

234

(при общем источнике инфицирования) заболевания, не склонные к эпидемическому распространению. Чувствительным и специфичным методом детекции ctxAB-оперона является генодиагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод применяют при исследовании выделенной культуры, проб воды, испражнений больных холерой людей или сред накопления.

Наличие гена холерного токсина (ctxAB), независимо от его экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп; кроме того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка TOX T, передающего сигналы запуска синтеза холерного токсина (CT), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные вибрионы О1 черезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.

Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы вызывают гибель в течение первых двух суток с типичным «синдромом холерогенности» кроли- ков-сосунков, зараженных 1х105 и 1x107 м.к. Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина, не вызывают гибели животных и изменений

вкишечнике или обуславливают накопление в кишечнике выживших или павших животных мутной, коричневато-желтой жидкости, т.е. развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Обязательной проверке на модели кроликов-сосунков

вотсутствии возможности определения гена холерного токсина подлежат следующие штаммы V. cholerae

О1 и О139 серогрупп:

235

а) выделенные от людей:

•гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы;

•гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;

•гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионовО1серогруппы,атипичныепосерологическим

свойствам и устойчивые к фагу эльтор и ctx+;

б) выделенные из объектов окружающей среды:

•гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, выделенные при отсутствии эпидемических осложнений по холере.

Для полной характеристики штаммов изучают чувствительность к антибиотикам (табл. 16).

Таблица 16 Пограничные значения диаметров зон ингибиции роста (мм) и величин МПК (мкг/мл) антибиотиков

в отношении Enterobacteriaceae

236