6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

•Исследование испражнений больного. Посев нативного материала.

•Посев испражнения больного на 2 чашки со средой Эндо или ЭМС.

Занятие 5. Бактериологический диагноз эшерихиозов

•Исследование испражнений больного. Выделение чистой культуры.

•Просмотр первичных посевов на дифференциальных средах Эндо (ЭМС).

•Отбор различных по морфологии колонии, постановка ОРА с частью колонии с ОКА-эшерихиозной поливалентной сывороткой.

•Посев на среду Клиглера и скошенный МПА колоний (не менее трех), давших положительную ОРА.

Занятие 6. Бактериологический диагноз эшерихиозов

•Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

•Просмотр посевов на среде Клиглера, на скошенном МПА; выбор для дальнейшей работы посева с подозрительным ростом на E. coli.

•Проверка чистоты роста мазком с окраской по Граму.

•Постановка ОРА с ОКА-эшерихиозной поливалентной сывороткой, с ОКВ-, ОКС-, ОКД-, ОКЕ-эшери- хиозными поливалентными сыворотками.

•Посев культуры, давшей положительную РА, в среды минимального дифференцирующего ряда, скошенный МПА.

•Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

217

Примечание: серологическую идентификацию культуры проводить со скошенного МПА.

Занятие 7. Бактериологический диагноз эшерихиозов

•Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

•Учет результатов роста в средах минимального дифференцирующего ряда.

•Проведение серологической идентификации выделенной культуры с О-эшерихиозными групповыми и факторными сыворотками и с Н-эшерихиозными сыворотками.

•Постановка РА с ОК-эшерихиозными иммуноглобулинами.

•Учет результата определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Занятие 8. Бактериологический диагноз эшерихиозов

•Исследованиеиспражненийбольного.Окончаниеисследования.

•Учет РА с ОК-эширихиозными иммуноглобулинами.

•Заключение по исследованию испражнений больного.

•Заполнение паспорта на выделенную культуту.

Занятие 9. Бактериологический диагноз шигеллезов

•Исследование испражнений больного. Посев нативного материала.

•Посев испражнения больного на чашку со средой Эндо (или ЭМС) и чашку со средой Плоскирева,

218

чтобы получить рост изолированных колоний.

Занятие 10. Бактериологический диагноз шигеллезов

•Исследование испражнений больного. Выделение чистой культуры.

•Просмотр первичных посевов на дифференциальнодиагностических средах Эндо (ЭМС) и Плоскирева.

•Отбор 3-5 подозрительных колоний, их посев на среду Клиглера и скошенный МПА.

Занятие 11. Бактериологический диагноз шигеллезов

•Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

•Просмотр роста на среде Клиглера, скошенном МПА.

•Отбор посевов с подозрительным ростом на возбудителя дизентерии.

•Проверка чистоты роста мазком с окраской по Граму.

•Проведение ориентировочной серологической диагностики выделенной культуры.

•Посев изучаемой культуры в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА, при подозрении на возбудителя дизентерии S. Sonnei - в среды Гисса с рамнозой, ксилозой и мальтозой.

•Постановка пробы с поливалентным дизентерийным бактериофагом.

•Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

Примечание: - посевы инкубируют 18-24 ч.

Занятие 12. Бактериологический диагноз шигеллезов

219

•Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

•Учет результата роста культур в средах минимального дифференцирующего ряда.

•Определение биовара выделенной культуры для S. sonnei.

•Учет пробы с поливалентным бактериофагом.

•Учет чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

•Проведение серологической идентификации выделенной культуры.

•Заключение по исследованию испражнений больного.

•Заполнение паспорта на выделенную культуру.

Занятие 13. Бактериологический диагноз сальмонеллеза

•Исследование испражнений больного. Посев нативного материала.

•Посев испражнения больного на чашку со средой Плоскирева и чашку ВСА.

•Посев испражнения больного в среду обогащения (магниевую).

•Исследование крови больного. Посев нативного материала.

•Посев крови больного в среду Рапопорт.

Занятие 14. Бактериологический диагноз сальмонеллеза

•Исследование испражнений больного. Выделение чистой культуры.

•Высев со среды обогащения на чашку ВСА.

•Просмотр первичных посевов на дифференциальных средах Плоскирева и ВСА (первые сутки).

220

•Посев подозрительных на сальмонеллы колоний на среду Клиглера и скошенный МПА.

•Исследование крови больного. Высев со среды накопления.

•Изучение роста в среде Рапопорт.

•Приготовление мазка с окраской по Граму.

•Приготовление раздавленной капли для изучения подвижности.

•Высев со среды Рапопорт на одну из дифференциальных сред: Плоскирева, Эндо или ЭМС и скошенный МПА.

•Серологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний и бактерионосительства.

•Постановка реакции Видаля с сывороткой крови больного.

•Постановка РПГА с сывороткой крови предполагаемого бактерионосителя и эритроцитарным Viдиагностикумом.

Занятие 15. Бактериологический диагноз сальмонеллеза

•Исследование испражнений больного. Идентификация выделенной культуры.

•Просмотр посевов на среде Клиглера, скошенном МПА, ВСА (вторые сутки).

•Отбор посевов с подозрительным ростом на сальмонеллы.

•Проверка культуры на чистоту роста мазком с окраской по Граму.

•Постановка ОРА с поливалентной сальмонеллезной сывороткой ABCDE.

•Посев изучаемой культуры в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА.

221

•Постановка пробы с сальмонеллезным бактериофагом.

•Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

•Просмотр посевов со среды обогащения на ВСА (первые сутки).

•Исследование крови больного. Выделение чистой культуры и идентификация выделенной культуры.

•Просмотр посевов на среде Плоскирева, ЭМС (высев со среды Рапопорт).

•Посев подозрительных на сальмонеллы колоний на среду Клиглера, скошенный МПА.

•Проверка культуры на чистоту роста на скошенном агаре мазком с окраской по Граму.

•Постановка ОРА с поливалентной сальмонеллезной сывороткой ABCDE.

•Посев изучаемой культуры в среды минимального дифференцирующего ряда, на скошенный МПА.

•Постановка пробы с сальмонеллезным бактериофагом.

•Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам дискодиффузионным методом.

•Серологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний и бактерионосительства.

•Учет реакции Видаля с сывороткой больного, выдача результатов исследования.

•Учет РПГА с сывороткой крови брюшнотифозного бактерионосителя и эритроцитарным Vi-ди- агностикумом, выдача результатов исследования.

Занятие 16. Бактериологический диагноз сальмонеллеза

•Исследование испражнений и крови больного. Окончание исследования.

•Учет результатов роста культур в средах минималь-

222

ного дифференцирующего ряда, на скошенном МПА.

•Учет пробы с сальмонеллезным бактериофагом.

•Серологическая идентификация выделенной культуры по схеме Кауфмана-Уайта.

•Учет чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

•Заключение, выдача результата исследования испражнений больного.

•Заполнение паспорта на выделенные культуры.

Занятие 17 (демонстрационное).

Определение генотипа, ассоциированного с патогенностью salmonella sp., методом полимеразной цепной реакции

В качестве одной из стабильных и перспективных мишеней в ДНК сальмонелл при использовании моле- кулярно-диагностических методов экспресс-диагно- стики (ПЦР и ДНК-зондирование) и анализа потенциальной патогенности штаммов выбран и используется фрагмент гена инвазивности inv, расположенный в пределах «острова патогенности» SP-I на хромосоме бактерий Salmonellae sp. Наличие данного гена (или всего«островапатогенности»)утестируемогоштамма свидетельствует о наличии у него инвазивных свойств

ипотенциальной патогенности.

•Приготовление суспензии 107 КОЕ/мл в дистиллированной Н2О из «чистой» культуры анализируемых штаммов сальмонелл.

•Проведение термоинактивации и экстракции тотальной ДНК сальмонелл путем прогревания суспензии микробов при 100 оС в течение 15 мин.

•Приготовление 1,4% агарозного геля и трисборатного буфера для гель-электрофореза.

•Осуществление программирования амплификато-

223

ра «Терцик» для ПЦР-детекции гена инвазивности (inv) сальмонелл.

•Подготовка реакционной смеси для постановки ПЦР и осуществление амплификации проб на термоциклере.

•Выполнениегель-электрофорезаампликоновиучет результатов ПЦР.

•Предварительное заключение о патогенности изучаемой культуры.

ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников для внесения всех компонентов амплификационной смеси. Устанавливают в штатив и маркируют пробирки для амплификации по числу исс­ледуемых проб и две дополнительные пробирки (положительный и отрицательный контроли­ ).

На одну пробу объемом 25 мкл готовят амплификационную смесь следующего состава:

1.2 мкл 10х ПЦР-буфера;

2.1 мкл 2,5 мМ раствора дНТФ;

3.1 мкл БСА;

4.Дистиллированная вода до - 20 мкл;

5.5-10 пкм каждого праймера (по 1 мкл);

6.0,2 мкл Таq-ДНК-полимеразы. Приготавливают общую амплификационную смесь

на все число проб и две пробы (положительный и отрицательный контроли). Перемешивают полученную смесь пипетированием и вносят в амплификационные пробирки по 20 мкл в каждую. Исследуемые образцы тотальной ДНК сальмонелл в количестве 5 мкл вносят в амплификационные смеси с помощью отдельных наконечников для каждого образца, после чего смесь перемешивают пипетирован­ ием и наслаивают 40-50 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника

224

объемом 200 мкл). В качес­ тве положит­ельного контроля применяют 2 мкл образца ДНК, экстрагированной методом кипячения из суспензии клеток штаммов S. typhimurium 4244 или другого вирулентного тестштамма сальмонелл, с концентрацией 1··107 КОЕ. В качестве отр­ ицательного контроля используют 5 мкл дистиллированной воды. Пробирки закрывают и помещаютвамплификаторсоследующейтемпературно­ - временной программой:

«горячий» старт – 94°С - 3 мин, затем 35 циклов: денатурация при температуре 94°С - 1 мин, «отжиг» 50°С - 1 мин, элонгация цепи при 72°С - 1 мин; завершающий этап при 72°С - 5 мин.

После амплификации препараты смешать с 3 мкл лидирующего красителя - бромфенолового синего. Для проведения электрофореза используется заранее приготовленный 1,4% агарозный гель. Гель-электрофорез проводится в трис-боратной буферной системе в течение 30 мин при напряжении 10 v/см. Визуализацию продуктов ПЦР осуществляют окрашиванием геля в течение 10 мин бромистым этидием в кoнцентрации 0,5 мкг/мл и видеорегистрацией результатов электрофореза цифровой камерой при помощи УФ-трансиллю- минатора с длиной волны 260-300 нм.

В положительных образцах должна наблюдаться интенсивно окрашенная полоса ампликонов ДНК, соответствующая размеру 240 п.н.

6.5. Приложение

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диско-диффузионным методом

При тестировании микроорганизмов семейства Enterobac-teriaceae рекомендуется использовать от-

225

дельныенаборыантибактериальныхпрепаратов(АБП) для определения чувствительности возбудителей:

•внекишечных инфекций (кроме инфекций мочевыводящих путей);

•кишечных инфекций (Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp.);

•внебольничных инфекций мочевыводящих путей. Готовят взвесь 18-20-часовой культуры в изотониче-

ском растворе хлорида натрия, содержащей примерно 1,5×108 КОЕ/мл. Инокулят в объеме 1 мл наносят на поверхность агаровой среды и равномерно распределяют путем покачивания чашки. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают 10-15 мин. Стандартные диски с антибиотиками накладывают с помощью пинцета на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку следует помещать не более 6 дисков. Инкубация 18-20 ч при 37ºС, при 35ºС - если использованы диски с цефалоспоринами и их комбинациями с клавулановой кислотой.

Результаты учитывают, измеряя диаметр зон задержки роста с точностью до 1 мм.

Интерпретация результатов оценки антибиотикочувствительности заключается в отнесении исследуемого микроорганизма к одной из трех категорий: резистентный(Р),промежуточный(П)ичувствительный(Ч)согласно таблице 13.

Таблица 13 Критерии интерпретации результатов определения

чувствительности Enterobacteriaceae: пограничные значения диаметров зон подавления роста (мм) и МПК (мг/л) АБП

226