Бесклеточная система трансляции

Минимальная	Полная
70S рибосомы E. coli	70S рибосомы E. Coli
иРНК	ИРНК
набор из 20 аминоацил-тРНК	набор из 20 аминокислот
фактор элонгации EF-Tu	набор 20 аминоацил-тРНК-синтетаз
фактор элонгации EF-Ts	набор из 20 тРНК
фактор элонгации EF-G	факторы инициации IF-1, IF-2, IF-3
ГТФ	фактор элонгации EF-Tu
Mg2+ (3-20 мМ)	фактор элонгации EF-Ts
	фактор элонгации EF-G
	фактор s терминации RF-1,RF-2,RF-3
	источники энергии: АТФ, ГТФ
	Mg2+ (3-20 мМ)

Минимальная система трансляции состоит из 8 компонентов. Ее основой являются рибосомы, выделенные из кишечной палочки, в качестве матрицы можно использовать синтетические или выделенные из прокариотических клеток иРНК. Материалом для синтеза полипептида служат присоединенные к транспортным РНК (тРНК) аминокислотные остатки – молекулы аминоацил-тРНК, а источником энергии – молекулы ГТФ. Кроме того, необходимы особые белки – факторы элонгации, которые участвуют в регуляции синтеза полипептида, а также ионы магния, предотвращающие диссоциацию рибосом на субъединицы.

Полная система трансляции содержит 17 компонентов. Она работает более эффективно и способна транслировать любые матрицы, в том числе эукариотические иРНК. В ней аминокислоты не активированы, но для их активации имеются 20 видов тРНК и набор особых ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз, которые присоединяют аминокислоты к тРНК с затратой энергии АТФ. Дополнительно к факторам элонгации добавлены факторы инициации и терминации, которые представляют собой регуляторные белки, обеспечивающие сборку и разборку белоксинтезирующей системы. Большое значение для функционирования белоксинтезирующей системы имеет также концентрация одновалентных ионов и температура.

Вместо прокариотических можно использовать эукариотические рибосомы, например, из проростков пшеницы. Однако для ее эффективной работы необходимо заменить все прокариотические регуляторные белки на соответствующие эукариотические. При этом вместо 3 факторов элонгации используются 2 эукариотических фактора – EF-1 и EF-2, вместо трех факторов инициации используются 10 эукариотических факторов  eIF-1, eIF-2, eIF-3, eIF4A, eIF4B, eIF4C, eIF4D, eIF4E, eIF4F и eIF-5, а вместо 3 факторов терминации – эукариотический фактор терминации eRF.

Уже из краткого описания белоксинтезирующих систем видно, что эукариотическая система содержит больше регуляторных белков, причем точкой приложения большинства из них являются начальные этапы трансляции, связанные со сборкой системы.

2.6. Биосинтез белка

Биосинтез белка состоит из трех этапов – инициации, элонгации и терминации.

На этапе инициации происходит сборка белоксинтезирующей системы. Она начинается с присоединения малой субъединицы рибосомы к 5’-концу иРНК. РНК-матрицы содержат копии структукрных генов  рамки считывания на некотором удалении от 5’-конца. Поэтому после присоединения к иРНК малая субъединица рибосомы сканирует нуклеотидную последовательность, передвигаясь от 5’- к 3’-концу, пока не найдет начало рамки считывания  стартовый кодон. В качестве стартового кодона прокариотическая рибосома использует кодон AUG и, реже, кодоны GUG и UUG. Эукариотическая рибосома в качестве стартового кодона использует только AUG.

В таблице генетического кода кодону AUG соответствует аминокислота метионин. Однако стартовый кодон в прокариотической белоксинтезирующей системе узнается специальной инициаторной тРНК, которая связана с модифицированной формой метионина – формилметионином. Поэтому любой полипептид, синтезированный in vitro с помощью бактериальных рибосом начинается с аминокислоты формилметионина. Эукариотическая белоксинтезирующая система также начинает полипептид с метионина, но это отнюдь не означает, что клеточные белки на N-конце всегда имеют метионин. После завершения трансляции они, как правило, подвергаются действию ферментов, которые удаляют или модифицируют их N-конец.

После опознания стартового кодона и связывания инициирующей тРНК субъединицы объединяются в полную рибосому. Процесс формирования рибосомы идет с затратой энергии ГТФ. При этом в рибосоме происходит восстановление двух центров связывания – аминоацильного и пептидильного. Аминоацильный центр способен распознавать и связывать аминоацил-тРНК (аминокислотные остатки в комплексе с тРНК), тогда как пептидильный центр удерживает пептидил-тРНК (синтезируемый полипептид в комплексе с тРНК). В синтезе полипептида принимает участие также и третий пептидилтрансферазный центр, расположенный на большой субъединице рибосомы, который катализирует образование пептидной связи.

Этап элонгации представляет собой собственно процесс синтеза полипептида в соответствии с таблицей генетического кода. Он состоит из повторяющихся стадий связывания, транспептидации и транслокации.

Перед началом следующего рабочего цикла аминоацильный центр (A-центр), расположенный в бороздке между субъединицами, содержит текущий кодон иРНК. На этой же поверхности в бороздке, но на некотором удалении от A-центра располагается пептидильный центр (Р-центр), который удерживает пептидил-тРНК. Между A-центром и Р-центром на большой субъединице располагается пептидилтрансферазный центр. Свободный N-конец полипептида обычно свисает в пространство, выходя по мере его удлинения за пределы рибосомы.

Стадия связывания состоит в распознавании и удержании рибосомой “клеверного листа” аминоацил-тРНК. При этом происходит конкуренция между разными аминоацил-тРНК, но в A-центре задерживается только та молекула, антикодон которой (триплет на вершине среднего лепестка клеверного листа) комплементарен находящемуся в A-центре кодону иРНК. В связывании аминоацил-тРНК с A-центром участвует фактор элонгации EF-Tu и затрачивается энергия ГТФ.

На стадии транспептидации аминоацил-тРНК в A-центре взаимодействует с пептидил-тРНК в P-центре таким образом, что происходит перенос C-конца полипептида из Р-центра в A-центр. При этом С-конец полипептида присоединяется к аминоацил-тРНК с образованием пептидной связи в ходе реакции, которая катализируется пептидилтрансферазным центром.

Во время стадии транслокации рибосома с участием EF-G и ГТФ, обеспечивает перенос пептидил-тРНК из A-центра обратно в Р-центр, из которого перед этим уходит свободная тРНК. Одновременно с возвратом полипептида в Р-центр происходит перемещение иРНК в направлении от 5’- к 3’-концу на один кодон.

Этап терминации наступает в тот момент, когда рибосома встретит в иРНК один из трех терминирующих кодонов – UAA, UGA или UAG. Эти кодоны не кодируют аминокислот и служат сигналами для окончания процесса биосинтеза белка. Терминирующий кодон ограничивает рамку считывания иРНК. Иногда рамка считывания ограничивается даже двумя и более терминирующими кодонами. Когда терминирующий кодон оказывается в A-центре рибосомы, он распознается факторами терминации RF-1 и RF-2 (или eRF эукариот). Связывание факторов терминации A-центром вызывает разрыв связи между тРНК и полипептидом в P-центре и выход белка из рибосомы. После этого из A-центра уходит фактор терминации, из Р-центра – свободная тРНК, а рибосома диссоциирует на субъединицы. Процесс разборки белоксинтезирующей системы идет с затратой ГТФ, с ним взаимодействует RF-3.

При диссоциации рибосомы малая субъединица может сканировать иРНК далее и возобновить трансляцию на следующей рамке считывания в случае полицистронных прокариотических матриц.