4 курс / Акушерство и гинекология / Кадырова_Л_В_Дифференцировка_Т_лимфоцитов_в_динамике_беременности

11

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на VI Съезде иммунологов России, Объединенном иммунологическом форуме, VI конференции по иммунологии репродукции (Нижний Новгород 2013г.); на V Российской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты» (Иваново, 2012г.); VI Всемирный конгресс по иммунопатологии и респираторной аллергии, VIII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ, V Съезде иммунологов России (Москва 2011г.); на XIV Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011г.); на VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010г.); IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь 2010г.); на научно-практической конференции молодых ученых ФГБУ “ИвНИИ МиД им. В.Н. Городкова” Минздрава России, Иваново 2011г., 2013 г; научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки - 2011», «Неделя науки - 2013» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской области» (Иваново, 2011, 2013гг.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 12 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикаций научных результатов диссертаций.

Объѐм и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного

12

текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, главы «Обсуждение полученных результатов», заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 215 источников, в том числе 39 отечественных и 176 иностранных. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 4 рисунками.

13

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Участие иммунной системы матери в контроле гестационного процесса в настоящее время ни у кого не вызывает сомнений [32, 21, 9]. В основе фундаментальных механизмов иммунологической толерантности организма матери к плоду и формирования фето-плацентарного комплекса лежит регуляция материнского иммунного ответа, осуществляемая активированными клонами Т- хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, регуляторных Т-лимфоцитов, ЕК, макрофагами и продуцируемыми ими цитокинами [9].

Начальным этапом развития адаптивных реакций иммунной системы является доставка антигена в органы иммунной системы и процесс презентации антигена специфичным клонам лимфоцитов [39]. Популяция Т-хелперов является основным звеном в запуске реакций адаптивного иммунитета, при этом усиление функциональной активности определенной субпопуляции Т-хелперов определяет тип иммунного ответа [39].

Цитотоксические Т-лимфоциты являются одним из важных компонентов эффекторной стадии иммунного ответа и осуществляют цитолитическое действие в отношении различных клеток-мишеней, опосредованное продукцией различных цитокинов и цитолитических молекул, а также индукцией апоптоза [39]. В последние время было показано, что уровень функциональной активности Т- хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов определяется стадией их дифференцировки [171, 95, 19, 30].

Беременность является уникальной моделью для изучения естественного парабиоза между генетически отличающимися организмами. Иммунные механизмы при беременности включаются уже на стадии имплантации оплодотворенной яйцеклетки и в дальнейшем в значительной мере обуславливают ее физиологическое течение [9]. Через 96 часов после

14

оплодотворения, клетки развивающегося эмбриона начинают экспрессировать МНС АГ отцовского происхождения, т.е. при беременности создается ситуация, определяющаяся постоянным контактом материнской иммунной системы с антигенами семиаллогенного плода [9, 27, 184, 113, 92]. Однако материнская иммунная система не только не отторгает, но и защищает плод.

Основным барьером, препятствующим массированному проникновению АГ плода в кровоток матери является плацента. При гемохориальном типе плаценты существует разделение материнского и плодового кровотоков [20]. Однако плацента не является непреодолимым барьером. Многочисленными исследованиями было показано, что в кровоток матери на протяжении всего гестационного процесса попадают небольшие фрагменты ворсин хориона,

микрочастицы синцитиотрофобласта [18, 27, 66, 92, 113, 183, 184, 149, 167].

Однако клетки ворсин трофобласта и синцитиотрофобласта не экспрессируют наиболее полиморфные антигены главного комплекса гистосовместимости класса Iа HLA-A,-B, и-C, а присутствующие на них антигены класса Ib MHC обладают низким уровнем полиморфизма и слабой способностью вызывать аллогенный ответ [194]. Данные об отсутствии молекулы МНС II класса на клетках трофобласта в настоящее время оспариваются [70], но большинство исследователей сходятся во мнении, что клетки трофобласта не экспрессируют молекулы МНС II класса [144, 194].

Несмотря на наличие этих механизмов, препятствующих стимуляции материнской иммунной системы антигенами плода, в последнее время появляются все больше работ, свидетельствующих о поступлении через плаценту в материнский кровоток различного материала, несущего эмбриональные антигены [147, 46]. Впервые фетальные клетки у беременных женщин обнаружили в 1960-е года уже на 15 неделе гестации [58, 203]. Так как во время беременности происходит длительная персистенция фетальных клеток в организме матери, то это приводит к развитию микрохимеризма. Микрохимеризм представляет собой явление, характеризующееся присутствием в многоклеточном организме небольшого количества клеток, которые происходят и самостоятельно

15

передаются в обход полового размножения от другого родственного многоклеточного организма и, следовательно, генетически отличны от клеток хозяина-носителя [147, 46, 58]. В последнее время эти данные получают все больше подтверждений и определяют новое направление в иммунологии беременности – исследование явления микрохимеризма [147, 46, 58, 203, 55, 211, 138]. Предполагают, что трансплацентарная миграция фетальных клеток естественна для нормального развития плаценты и плода, и их циркуляция во время беременности осуществляет важную роль в индукции иммунологической энергии и/или толерантности у матери и плода [93]. В настоящее время известно, что фетальный микрохимеризм возможен уже на ранних стадиях беременности вскоре после имплантации [55, 211] и нарастает по мере прогрессирования беременности [127, 162]. После родового процесса количество фетальных клеток снижается, но их можно обнаружить и спустя большое количество лет [138]. Так, Bianchi с соавторами обнаружили мононуклеарные клетки плода в материнском кровотоке через 27 лет после родов [138]. Кроме того, в литературе имеются сведения о том, что микрохимерные клетки можно выявить в щитовидной железе, сердце [138]. Значительное количество клеток плода, попадая в организм матери, в силу анатомических особенностей, прежде всего, накапливаются в дренирующих матку лимфатических узлах, где и происходит знакомство материнских Т-лимфоцитов с антигенами плода [35], но могут присутствовать в селезенке [71] и печени [120]. Выявление фетальных клеток в материнских тканях на протяжении продолжительного времени после беременности регистрируется значительно чаще, чем миграция материнских клеток в кровоток плода [136].

Все эти данные свидетельствуют о том, что во время беременности контакт материнских иммунных клеток с антигенами плода отцовского происхождения осуществляется в течение длительного времени. Такая ситуация, казалось бы, должна сопровождаться патологическим ответом со стороны иммунной системы матери, но в норме этого не происходит, и только при осложнениях гестационного процесса отмечается развитие цитотоксических и аутоиммунных реакций [166, 195]. Как показывают исследования, микрохимеризм предполагает

16

присутствие в организме человека не более 1% чужеродных клеток от всех клеток индивида [46]. При патологии беременности, в частности при преэклампсии и досрочном прерывании беременности количество клеток микрохимер плодового происхождения в организме матери значительно выше [166, 38, 195], что, вероятно, может способствовать развитию цитотоксических и аутоиммунных реакций, направленных на отторжение плода [176, 102]. Как предполагают различные исследователи, повышение уровня антигенного материала плодового происхождения в периферическом кровотоке беременной женщины при патологии беременности происходит в результате нарушения плацентарных барьеров [9, 184]. Следовательно, стимуляция иммунной системы матери антигенами плода является необходимым фактором нормального развития беременности [9], но избыточное поступление АГ при нарушении барьерной функции плаценты приводит к формированию патологии беременности [167, 152].

Согласно современным представлениям, беременность на всем протяжении сопровождается изменением состояния иммунной системы матери, направленным на сохранение плода [9]. Представления об иммунологическом взаимодействии матери и плода все еще во многом остаются гипотетическимии. Существует большое количество гипотез, пытающихся объяснить феномен неотторжения плода [57, 69, 98, 151, 76, 56], однако, самостоятельно ни одна из выдвинутых теорий не объясняет до конца сути феномена. Рабочими в настоящее время являются следующие гипотезы: об иммуномодулирующих свойствах клеток трофобласта и уникальном наборе антигенов главного комплекса гистосовместимости, экспрессируемом на них [57], инволюция тимуса во время беременности [69], продукции блокирующих растворимых факторов, поддерживающих иммунное равновесие при беременности [98], усиление активности клеток с супрессивным действием [151, 76], изменение баланса в соотношении Th1/Th2 клеток в сторону преобладания Т-хелперов 2 типа [56].

Последняя из теорий являлась наиболее популярной теорией в иммунологии репродукции. В ней Wegmann T.G. с соавторами (1993) показали, что

17

преимущественное развитие иммунного ответа по гуморальному типу менее опасно для плода, в то время как Th1 тип иммунного ответа определяет потенциально враждебный для плода клеточно-опосредованный иммунный ответ [56]. Однако был получен ряд экспериментальных и клинических данных, не укладывающиеся в рамки этой теории [68, 164]. Оказалось, что выявление в крови повышенного содержания комплекса цитокинов Th1 типа иммунного ответа не всегда коррелирует с неблагоприятным течением и исходом беременности и, наоборот, при акушерской патологии может отмечаться высокий уровень цитокинов Th2 типа иммунного ответа [68, 164]. Цитокины, продуцируемые Th1 и Th2 клетками, определяют характер иммунного ответа, при этом активация Т- хелперов 1 типа способствует развитию клеточного, а Тh2 - гуморального иммунного ответа [12]. С другой стороны развитие того или иного типа иммунного ответа ассоциируется с определенным цитокиновым фоном [39].

Считается, что неадекватный ответ материнской иммунной системы играет важную роль в развитии привычного невынашивания, идиопатического бесплодия, самопроизвольного выкидыша и преэклампсии [41, 9, 133, 163].

В последнее время большое внимание уделялось исследованию супрессии материнского иммунного ответа в результате увеличения во время гестации уровня регуляторных Т-лимфоцитов [48, 209, 169]. Известно, что иммунный ответ на антиген включает индукцию не только эффекторных Т-клеток, осуществляющих элиминацию антигена, но и регуляторных Т-лимфоцитов, специфичных к антигену и ограничивающих экспансию эффекторных Т- лимфоцитов и иммунный ответ в целом [207]. Различают 2 типа Тreg: натуральные (естественные) и индуцированные. Натуральные Тreg развиваются в тимусе путем селекции, опосредованной высокоавидным взаимодействием Т- клеточного рецептора c соответствующим лигандом и в последующем расселяются в периферические лимфоидные органы [52]. Скорость образования натуральных Treg постоянна в течение всей жизни. Естественные Treg играют важную роль в механизмах системного гомеостаза, контролирующего в организме общее количество лимфоцитов [7].

18

Индуцированные Тreg появляются на периферии в результате иммунной стимуляции клеток CD4+CD25-Foxp3- или могут быть стимулированы ex vivo [103]. Высокая значимость популяций регуляторных Т-лимфоцитов в индукции материнской толерантности к полу-аллогенному плоду была установлена, как в экспериментальных работах на лабораторных животных [50, 41, 49, 63], так и при исследовании беременности человека [50, 76, 148, 99, 214, 62]. Было установлено, что уровень Treg, циркулирующих в периферической крови и находящихся в децидуальной оболочке плаценты, увеличивается в период ранней беременности, достигает максимального уровня во втором триместре и постепенно снижается к родам до уровня небеременных [50, 76, 148, 99, 214]. Считается, что рост уровня Treg при беременности непосредственно связан с подавлением реактивности на анти-отцовские аллоантигены [214, 62]. Наряду с вышесказанным, высокая значимость Treg в поддержании иммунного гомеостаза во время беременности подтверждается данными о снижении их уровня при спонтанных абортах [41, 76] и преэклампсии [45, 159, 168]. Тreg могут продолжительное время выживать без деления вне контакта со специфическим антигеном [191]. Эти клетки экспрессируют на своей поверхности L-селектин и находятся при этом в циркуляции как наивные Т-лимфоциты [191]. Тreg могут оседать в лимфатических узлах, а при непосредственном контакте со специфическим антигеном начать пролиферировать [191]. При этом Тreg эффективно угнетают иммунный ответ и препятствуют выходу эффекторных Т-клеток, снижая экспрессию их хемокиновых рецепторов [191]. При первичном иммунном ответе на инфекционные антигены эти клетки сдерживают активность эффекторных Т- лимфоцитов, подавляя их пролиферацию, цитотоксическую активность и продукцию цитокинов Th1 и Th2 типов иммунного ответа [3]. Повторные антигенные стимуляции не только усиливают иммунитет, пополняя пул Т-клеток памяти, но и повышают супрессорную активность CD4+CD25+Foxp3+ Treg [3].

Таким образом, при беременности существует особый баланс между процессами активации одних реакций иммунной системы и супрессией других [9, 50, 169, 52]. Только в этом случае запускается каскад реакций, регулирующих

19

формирование фето-плацентарного комплекса и способствующий пролонгированию беременности [9]. Нарушение баланса между супрессорными и активирующими сигналами может привести к развитию патологических состояний [9, 41, 76, 45, 159, 168].

Важным механизмом иммунорегуляции при беременности является активация Т-лимфоцитов, изменение характера их дифференцировки, продукции цитокинов и цитолитических молекул. Как известно, Т-клеточный гомеостаз в организме определяется балансом между процессами образования лимфоидных клеток и их гибели [94]. Основным источником Т-клеток является тимус, который играет ключевую роль в установлении и поддержании периферического Т- клеточного пула [161]. Дифференцирующиеся в тимусе Т-клетки являются наивными, так как ранее не вступали в контакт с чужеродными антигенами [129, 34]. Формирующиеся в тимусе Т-клетки проходят процессы позитивной и негативной селекции, и поступают в периферический кровоток, обладая потенциальной способностью взаимодействовать с конкретным антигеном [197, 200].

Известно, что у взрослых людей наивные Т-лимфоциты пролиферируют с небольшой интенсивностью, делению на периферии подвергается только около 1% наивных CD4+ и CD8+ клеток [199]. Однако при некоторых патологических состояниях механизмы пополнения наивных Т-клеток отличаются от таковых в норме [1]. Так, при многих аутоиммунных заболеваниях, лимфомах, вируснобактериальных процессах, наблюдается изменение показателей Т-клеточного гомеостаза (общего количества лимфоцитов, соотношения CD4+/CD8+, CD45RA+/CD45RO+ лимфоцитов и др.) [1]. Иммунная система матери во время беременности также подвергается воздействию целого ряда факторов [184, 9, 33], что может определять включение иных механизмов поддержания Т-клеточного гомеостаза при данном физиологическом состоянии. Во многих работах указывается, что беременность сопровождается атрофией тимуса, выраженной в снижении его массы и клеточности, главным образом за счет атрофии коркового слоя и истощения популяции кортикальных тимоцитов [210, 43, 84]. Но это не

20

вызывает изменений в абсолютном содержании периферических лимфоцитов на всем протяжении гестации [38].

Предполагается, что во время беременности механизмом компенсации частичного подавления тимического пути развития лимфоцитов является процесс экстратимической дифференцировки Т-клеток [33, 87]. Так в работах ряда авторов было показано, что экстратимическая дифференцировка лимфоцитов во время беременности может проходить в лимфатических узлах, дренирующих матку, в децидуальной оболочке матки и в печени [35, 42].

Согласно данным литературы, Т-клетки экстратимического происхождения немногочисленны особенно в детском возрасте, когда в тимусе еще не происходит возрастная инволюция. Однако по мере старения организма количество таких клеток возрастает [43]. Показано, что количество экстратимически дифференцированных Т-клеток увеличивается при аутоиммунных заболеваниях, стрессе и во время беременности [43].

Ряд исследователей считают, что экстратимическая дифференцировка во время неосложненной беременности может индуцироваться эстрогенами плаценты и активацией симпатических нервов [81, 88, 143]. Кроме того, на процесс внетимической дифференцировки Т-лимфоцитов могут оказывать влияние цитокины плаценты и децидуальной оболочки беременной матки, в частности OSM (онкостатин М), концентрация которого в сыворотке беременных женщин значительно выше по сравнению с аналогичным показателем небеременных женщин [36, 37].

Наряду с усилением экстратимического пути дифференцировки, постоянный уровень Т-лимфоцитов при различных состояниях, связанных с нарушением тимической дифференцировки, может компенсироваться гомеостатической пролиферацией наивных клеток на периферии [126]. Гомеостатическая пролиферация клеток реализуется при помощи как гуморальных, так и контактных механизмов [39]. Основную роль в поддержании наивных Т-клеток играет IL-7. По литературным данным известно, что IL-7 в небольших количествах продуцируется стромальными клетками костного мозга,