8542

31

Статистическая обработка результатов. Сравнение частот ПХЭ с МЯ в опыте и контроле проводится по критерию Стьюдента при предвари¬ тельном преобразовании данных по каждому животному

г - число ПХЭ с МЯ у животного; п - общее число ПХЭ у животного.

Все экспериментальные данные обрабатываются статистически. 2. Метод учета индуцированных микроядер в растительных

клетках (корешки гороха). Теория.

Данный метод выявляет структурные повреждения хромосом. Микроядра (МЯ) формируются из фрагментов или целых хромосом, утративших связь с центромерой и не включающихся в ядра дочерних клеток во время митоза. В цитоплазме дочерних клеток МЯ различимы

ввиде округлых тел диаметром от 1/20 до 1/5 ядра клетки. Наблюдаются также более значительные повреждения хромосом или митотического аппарата клетки, приводящие к образованию клеток с фрагментированными ядрами.

Материалы и оборудование: микроскоп, предметные и покровные стекла, фиксированные корешки гороха, репаровальные иглы, эл. плитка, пробирки с обратным холодильником.

Реактивы: ацетбкармин, 45%-ная уксусная кислота, этиловый спирт.

Ход работы. Для проведения эксперимента необходимо приготовиi ь давленный ацетокарминовый препарат по указанной ниже методике и изучить его под микроскопом, а именно подсчитать количество клеток с МЛ не менее, чем в 10 полях зрения, а также общее количество клеток

вкаж /и »м поле зрения. Результаты исследования занести в таблицу и определить процентное содержание клеток с МЯ в опыте и контроле.

Приготовление давленного временного ацетокарминового препарата. Растительные корешки или проросшие семена вынимают и г фиксатора Кларка (либо другого) или 70-градусного этилового спирта и помещают в небольшую пробирку с обратным холодильником с ацето¬ кармином, налитым в таком количестве, чтобы полностью покрыть корешки Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Необходимо следить, чтобы уровень воды в бане был ниже краев пробирки. В качестве бани можно использовать химический стакан, на дно которого помещаю в слой ваты или фильтровальной бумаги. В процессе нагревания в ацетокармине происходит не только

32

окрашивание, но и мацерация матерпана (размягчение). Мацерируют мелкие корешки - 6-8 мин., крупные -10 мин Оставляют пробирку на 10 мин. до полного охлаждения (объект окрашивается). Для получения удачной окраски ацетокармином большое значение имеет качество красителя.

Окрашенный корешок помещают на предметное стекло в каплю 45%-ной уксусной кислоты, отрезается темно окрашенная меристематйческая чаем, корешка, остальная часть корня удаляется. Разрезанные корешки накрывак>1 покровным стеклом, которое, в свою очередь, накрывают 2-мя слоями фильтровальной бумаги, и не сдвигая покровное стекло обратной стороной иглы, легко постукивая по нему, располагают клетки в монослой. Затем, придерживая покровное стекло, круговым вращательным движением обратной стороной иглы уплощают клетки. Готовый препарат анализирую! под микроскопом.

Лабораторная работа №7

Метафазный анализ перестроек хромосом у растений, на примере

Crepis capillaris (Скерда)

Цель: Овладение основами метафазного анализа перестроек хромосом с использованием растения семейства сложноцветных Crepis capillaris - скерда зеленая.

Задачи:

1)приготовить рабочий раствор;

2)провести анализ препаратов, подсчитав отдельно по корешкам число клеток с нормальными метафазами и число клеток с перестройками хромосом;

3)схематично зарисовать аберрации.

Материалы и оборудование:

1.Абсолютно этиловый спирт (очищенный); 2.Ледяная уксусная кислота (98-99%-ная); 3.Дистиллированная вода; 4.Кармин; 5.Мутаген; 6.Лак;

7.Хлоралгидрат - 5%-ный. Теоретическая часть:

33

При овладении основами метафазного анализа перестроек хромосом используют растение семейства сложноцветных Crepis capillaris - скерда зеленая, в соматических клетках которого содержится 3 пары хорошо различимых хромосом. Пара наиболее крупных субметацентрических хромосом носит название А-хромосом. Средняя по величине пара акроцентрических хромосом со спутниками получила обозначения Д- хромосом. Самые маленькие в наборе акроцентрические хромосомы обозначаются как С-хромосомы. Длина А-хромосом равняется 7,6 мкм, Д- хромосом -6,4 мкм и С-хромосом - 4,3 мкм. Наличие в соматических клетках всего 3 пар хромосом позволяет точно учесть вбе типы хромосомных и хроматидных перестроек в каждой отдельной хромосоме.

Ход работы:

1)Приготовление рабочего раствора:

Фиксирующая смесь - абсолютный этиловый спирт: ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1 (готовится перед употреблением); Ацетокармин: 1 г кармина растворяют в 100 мл 45%-ной уксусной кислоты и кипятят в течение часа. После кипячения встряхивают и фильтруют, предварительно остудив. Кипячение проводят под тягой в колбе с обратным холодильником, т.к. улетучивание уксусной кислоты снижает проникающую способность красителя. Хранить в темной

посуде, перед употреблением профильтровать; Колхицин - 0,01%-ный раствор колхицина в дистиллированной

воде. Хранить при температуре +4° С в темной посуде; Растворы разной концентрации мутагена (от 0,5%-ной до Ю"6° Л).

2)Порядок работы по проведению метафазного анализа перестроек хромосом: v

1.Воздушно-сухие семена скерды зеленой разложить на фильтровальной бумаге в чашках Петри и прорастить до появления корешков (48 часов);

2.Обработать корешки величиной 1-2 мм раствором мутагена разной концентрации (от 0,5%-йой до Ю,60/Л). В одной чашки корешки оставить необработанными - контроль;

3.Оставить обработанные корешки в чашках Петри (и контроль) при комнатной температуре на 6-8 часов до появления первого митоза; 4.Перенести материал на 2 часа в раствор колхицина 0,01%-ный

для накопления метафаз; 5.Отмыть корешки от колхицина и перенести их в фиксатор из

смеси ледяной уксусной кислоты и абсолютного спирта (1:3); 6.Выдержать корешки в фиксаторе не менее суток;

34

7.Приготовить временные ацетокарминовые препараты из раздавлен нм

корешков (при работе с растением корешки из фиксатора помещают в небольшую пробирку высотой 5-10 см с ацетокармином, налитом в таком количестве, чтобы полностью покрыть корешки. Пробирку закрывают резиновой пробкой, в которую вставлена длинная трубка, играющая роль обратного холодильника. Пробку помещают в кипящую баню на 10 минут, в качестве бани используют химический стакан, на дно которого помещаю слой ваты или фильтровальной бумаги). В процессе нагревания в ацетокармине происходит не только окрашивание, но и мацерация материала. Длительное нагревание может вызвать разбухание и фрагментацию хромосом. Поэтому мелкие корешки мацерируют 6-8 мину < крупные - 10 минут. Оставляют пробирку до полного охлаждения и окрашивания объекта;

8.Корешок давят на предметном стекле в капле хлор гидрата (под покровным стеклом) под двойным слоем фильтровальной бумаги;

9.Провести идентификацию аберраций хромосом; ,10. Провести анализ препаратов, подсчитав отдельно по корешкам

число клеток с нормальными метафазами и число клеток с перестройками хромосом;

11 Клетку с кажущимся изменением хромосом проанализировать, сравнивая с контролем и аберрацию схематично зарисовать;

12.Результаты анализа заносятся в таблицу;

13.Сделать необходимые выводы.

Тема: Метафазный анализ аберраций хромосом в клетках костного мозга крыс.

Цель: Овладение основами метафазного анализа аберрации хромосом с использованием клеток костного мозга крыс.

Задачи:

1)Приготовление препаратов;

2)Анализ хромосомных аберраций на стадии метафазы. Материалы и оборудование:

1.Колхицин;

2.Хлористый^калий;

3.Цитрат натрия;

4.Метанол;

5.Ледяная уксусная кислота;

6.Дистиллированная вода;

7.Эозин водо-растворимый;

8.Азур II, ,

35

Теоретический часть:

Кариотип крысы состоит из 42 хромосом. Представлен как акроцентрическими, так и метацентрическими хромосомами. Существуют различные варианты строения хромосом у разных линий крыс. Приведем кариотип колонии нелинейных крыс (питомник «Рапполово»),

У разных линий крыс обнаружен полиморфизм Х-хромосомы и третьей тары аутосом.

Для успешного анализа хромосомных аберраций на стадии метафазы необходимо хорошее знание кариотипа крысы и мыши. Необходимо правильно отобрать клетки для исследования. Для этого пригодными считаются метафазные пластинки, удовлетворяющие следующим требованиям:

1)все хромосомы должны быть хорошо прокрашены;

2)не допускается наличие нескольких случайных хромосом в поле зрения;

3)уровень конденсации хромосом следующий: максимум - малые акроцентрические хромосомы видны; минимум - хромосомы разделены на две хроматиды и лежат отдельно друг от друга;

4)не допускается наличие в метафазной пластинке хромосом, вошедших в анафазу

5)не допускается анализ метафазных пластинок с большим количеством наложений хромосом.

Всего анализируется 100 клеток хромосом.

При учете аберраций нужно помнить, что пробелы в качестве аберраций не учитываются, их регистрируют отдельно.

При учете числа поврежденных хромосом, в* результате выявления' мутагенного фактора, следует иметь в виду следующие моменты:

1)каждый одиночный и парный фрагменты и обмены с сестринским слиянием хроматид, учитывается как одна поврежденная хромосома;

2)из аберраций хромосомного типа учитывают как две поврежденные хромосомы каждый случай ацентрических колец, кольцевых моноцентрических хромосом, перитцентрический и парацентрических инверсий, реципрокных транслокаций, дицентрических хромосом;

3)из обменных аберраций хроматидного типа как две поврежденные хромосомы считают случай внутрихроматидных внутриплечевых обменов, внутрихромасомных межплечевых обменов,

36

хроматидохроматидных обменов между двумя хромосомами, хроматйдоизохроматидных обменов;

4)при участие в обмене 3-х и более хромосом число поврежденных хромосом оценивают относительно числа разрывов.

Ход работы: 1)Приготовление раствора:

Колхицин - 2,5 мг/л (растворить в дистиллированной воде, хранить в холодильнике при 4-5° С); 0,55% раствор КС1 или 1%-ный раствор цитрата натрия;

Метанол: ледяная уксусная кислота в отношении 3:1; Смесь 0,1%-ного раствора азура и 0,1%-ного раствора эозина с

дистиллированной водой: 60 мл азура, 30 мл эозина, 100 мл воды. 2)Приготовление препаратов хромосом:

Для накопления клеток в стадии метафазы за 2 часа до приготовления препаратов крысам вводят раствор колхицина. Выделяют и очищают с помощью марли бедренные кости. Обычно на 1 крысу достаточно одной бедренной кости. Срезают эпифизы и, при помощи шприца, костный мозг вымывают 1%-ным раствором цитрата натрия или средой Игла. Фиксацию клеток проводят в трех сменах смеси метанол-уксусная кислота в соотношении 3:1. Продолжительность первой фиксации -10 минут, последующих 15-20 минут. Полученную в последней порции фиксатора клеточную взвесь желаемой плотности наносят каплями на охлажденное, смоченное водой предметное стекло. Окраска препарата 30-40 минут смесью 60 мл 0,1%-ный раствор азура, 30 мл 0,1%-ный раствор эозина и 100 мл воды. Ополаскивают водопроводной водой и высушивают.

3)Схематично зарисовать аберрации.

4)Составить таблицу, состоящую из показателей: общее число проанализированных клеток, число клеток с аберрациями хромосом, общее число аберраций, общее число поврежденных хромосом, типы аберраций.

5)Сделать соответствующие выводы.

Лабораторная работа № 8

Тема: определение процентного содержания полового хроматина в слизистой оболочке рта.

37

Цель: изучение влияния неблагоприятных факторов средьпна здоровье человека.

Задачи:

изучить и сравнить содержание полового хроматина у людей: 1)проживающих в сравнительно чистых экологических условиях и

в загрязненных районах; 2)у здоровых людей и у людей с паталогией;

3)у людей, связанных с производством вредных веществ^ и здоровых;

4)у людей, работающих на ЭВМ, и здоровых. Исследовать от каждого человека по два препарата. Полученные данные внести в таблицы (см. таблицу).

Оборудование и материалы.

1.Микроскоп типа МБР-1, МБР-3, МБИ-3 - 10 шт. 2.Спиртовки - 10шт.

3.Шпатели металлические -10 шт.

4.Чистые стаканы - 10 шт.

5.Дистиллированная вода - 500 мл.

6.Предметные стекла - 20шт.

7.Покровные стекла - 20шт. 8.Осветитель типа ОИ-19 - 10шт. 9.Фиксатор Кларка - 100мл. 10.Этиловый спирт - 100 мл. 11.Пинетки глазные чистые - 10шт.

12.Ледяная уксусная кислота - 100 мл. 13 45% уксусная кислота - 100мл.

14.Ацетоорсеин — 100 мл,

15.Фильтровальная бумага - 1 кв. м.

16.Марля - 1 кв. м.

17.Ножнйцы - 5 шт.

18.Иммерсионное масло - 10 мл.

19.Стеклянные палочки - 10 шт. 20.Парафин - 10 г или лак - 1 пузырек. 21.Препаровальные иголки - 10 шт. 22 Спички.

23. Химические стаканчики. Теоретическая часть.

38

Комплекс ДНК с белками, имеющий специфическую структурную организацию, получил название хроматина. Существенные элементы хроматина-нуклеосомы, дисковидные частицы 10 нм в диаметре.

Изучение хромосом показывает наличие двух родов хроматина в составе хромосом, а именно эухроматина и гетерохроматина.. На гигантских хромосомах эухроматин - это хорошо оформленные районы хромосом с рисунком дисков. Наряду с зухроматином видно, что некоторые части хромосом, обычно расположенные в районах центромер в клетках слюнных желез, конденсируются, окрашиваются в темный цвет и заполняются как бы пузырьками. Эти районы получили название гетерохроматических (половой хроматин представляет особый случай гетерохроматизации). В ядрах клетокслюнных желез гетерохроматин определенных участков разных хромосом располагается в одном месте, образуя так называемый хромоцентр., В некоторых случаях отдельные хромосомы могут целиком содержать только гетерохроматин. Хроматин состоит из ДНК, белков и синтезируемых в ядре молекул РНК.

Метод определения, процентного содержания полового хроматина обычно применяется параллельно с микроядерным тестом.

Вядрах клеток эпителия слизистой оболочки щеки тельце полового хроматина всегда прилегает к оболочке ядра.

Воснове метода лежит способность Х-хромосомы находиться длительное время в инактивированном состоянии и проходить клеточный цикл синхронно с аугосомами. Инактивированная Х- хромосома образует так называемый половой хроматин или тельце Барра, Отчетливо выявляемый в интерфазном ядре на фоне деспирализованных хромосом.

Инактйвация одной Х-хромосомы позволила рассматривать половой хроматин как морфологическое выражение компенсации дозы гена.

Половой хроматин интенсивно красится всеми основными ядерными красителями.

Периферическое расположение тельца полового хроматина не является случайным. Известно, что гетерохроматин всегда стремиться скапливаться m периферии ядра. (Прокофьева-Белы овская, 1969).

Исследование полового хроматина является экспресс методом ^ для 1ыявления синдромов, связанных с ненормальным набором половых хсромосом и для выясннния генетических последствий повышенной гюнизации и действия других неблагоприятных условий окружающей среды. Метод определения подового хроматина позволяет

39

быстро получить ориентировочные данные о системе половых хромосом. Он позволяет одномоментно подвергнуть обследованию большие группы людей.

Ход работы.

Перед взятием мазка необходимо прополоскать рот. 1.Стерильным шпателем сделать соскоб со слизистой оболочки

полости рта (в внутренней поверхности щек).

2.Размазать соскоб возможно ровнее по середине предметного стекла

3.Зафиксировать мазок, проводя его через фиксатор Кларка и этиловый спирт (96-98°).

4.Подсушить препарат на воздухе (после фиксации мазок можно хранить неопределенно долго).

5.Окрасить препарат, поместив на мазок 2-3 капли ацетоорсина в течение 5-10 минут.

6.Препарат закрыть покровным стеклом и с помощью фильтровальной бумаги удалить избыток красителя. Приготовленный таким образом препарат является временным, т.к. по мере подсыхания красителя он приходит в негодность. Для приготовления постоянного препарата окрашенный мазок ополаскивают (дифференцируют) в 15 - 30% растворе уксусной кислоты, высушивают на воздухе и заключают в канадский бальзам.

7.Исследование препарата под микроскопом необходимо начинать с малого увеличения (объектив х8, окуляр х-10).

8.Найдя участок с большим количеством клеток, перейти к масляной иммерсии (х90).

9.Исследованию подвергаются лишь те ядра, которые находятся в интерфазе митоза.

10.Подсчитать 100 интерфазных ядер, отмечая при этом количество ядер с половым хроматином (установить процент ядер с половым хроматином).

11.Зарисовать интерфазное ядро с половым хроматином. Примечание. При использовании временных препаратов соскоб сразу помещают в каплю красителя (ацетокармнн, ацетоорсеин) на предметное стекло, закрывают покровным. Через 5-10 минут промокают сверху фильтровальной бумагой и окантовывают края покровного стекла парафином или лаком.

Процентное содержание полового хроматина вычисляется как отношение числа клеток с половым хроматином щ к общему числу клеток п. гц/ п х100% (nio/noxl00%; nki/nix!00%)

40

55/110x100% — 50% 50/ 110x100% - 49% (опыт) (контроль)

Сравнить данные, полученные в опыте с результатами контроля: По-число клеток в полях зрения (опыт); По-число клеток в полях зрения (контроль);

По - общее число клеток с половым хроматином (опыт); nki - общее число клеток с половым хроматином (контроль).

Лабораторная работа № 9

Тема: Изучение гигантских хромосом в слюнных железах личинки хирономуса

Теоретическая часть Каждый вид организмов имеет свой постоянный набор хромосом,

свокупность которых составляет кариотип вида. Наряду с обычными, метафазными хромосомами известны так называемые гигантские или маленькие хромосомы, которые встречаются у некоторых личинок укрылых насекомых (дрозофил, хирономуса и др.). Они достигают 100- 0 мкм в длину и до 15-25 мкм в ширину. Полигения возникает в результате эндомитоза, т.е. редупликация хромосом без их расхождения, в клетках слюнных желез находится в интерфазном состоянии, в котором мелодичные хромосомы взаимно притягиваются - соматическая нъюгация.

Увеличение степени политении происходит в процессе личиночного развития, поэтому, чем старше личинка, тем толще ее политенные хромосомы, тем больше степень политении.

Строение политенных хромосом представляет большой интерес с точки зрения цитогенетики. Каждая хромосома вдоль длины разбита на