8542

21

набор хромосом обозначают как «2п».Г1оловым клеткам свойствен гаплоидный набор хромосом, гаметический, который представлен одним из гомологов каждого типа хромосом. Гаплоидный набор обозначается как «п» Различают еще основное число или основной набор хромосом, обозначаемый и через букву — х. Основное число — это исходный набор хромосом, который лег в основу при возникновении полиплоидных клеток. При х * 7 диплоидный организм будет иметь 2п = 2х = 14, п = х = 7, тетраплоидный — 2 п = 4х = 28, а =

14, х = 7.

Морфология хромосом изучается на хромосомах метафазных пластинок меристематических тканей. Чтобы получить понятие о кариотипе данного вида, изучают несколько десятков метафазных клеток скольких особей данного вида. За постоянное число хромосом, характерное для вида, принимается то число, которое чаще встречается в меристематических тканях. В основе классификации хромосом лежит расположение центромерного района, т. е. первичной перетяжки, делящей хромосому на два плеча. Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку, которая может быть расположена на разных участках плеча. 1C л и вторичная перетяжка расположена на дистальном конце хромосомы, она отделяет маленький участок хромосомы - спутник, который соединяется с телом хромосомы тонкой нитью. Как правило, нить спутника шляется ядрышкообразующим районом хромосомы. Если два плеча хромосомы имеют одинаковую длину или почти равны, то такие хромосомы зазывают метацентрическими или равноплечими. Если же одно плечо фомосомы

выделяют еще гелоцентрические хромосомы с центромерой, расположенной на конце фомосомы, но у таких хромосом обнаружено второе очень короткое плечо, г. е. эти хромосомы являются акроцентрическими.

Тио и Леван(1956) предложили называть хромосомы летацентрическими, если плечевой индекс, т. е. отношение

’’ длинного тлеча к короткому равен 1-1,3; субметацентрическими — при плечевом индексе, равном 1,4-1,7; субакроцентри-, ческпми - 1,7-3;акроцентрическими - при плечевом индексе больше 3,

Сравнительный анализ кариотипов проводят на кариограммах и идиограммах. Кариограмма — это систематизированный типичный набор хромосом единичной клетки, выполненный с помощью рисунка

22

или путем вырезания хромосом из микрофотографий, Идиограмма — это схематизированное изображение хромосомного набора в виде диаграммы, показывающей относительные размеры хромосом и положение центромерных перетяжек, построенной на основе измерения хромосом ряда клеток.

Для построения кариограммы и идиограммы прежде всего необходимо идентифицировать хромосомы, определить гомологичные пары. Для этого учитываются линейные параметры хромосом,, положение центромерных районов, наличие вторичных перетяжек, спутников. Определяется длина каждого плеча хромосомы средняя из длины двух хроматид плеча.

Измерения проводятся не менее чем на тридцати хромосомных наборах. Полученные данные обрабатываются биометрически, и определяется достоверность средних величин.

h- 1

где щ — nbn2,... nn— число проанализированных метафаз; V*-— VbV2,...,Vn — число хромосом в метафазе;

М — средняя арифметическая числа хромосом в метафазе; m - средняя ошибка средней арифметической;

а — среднее квадратическое отклонение; t — критерий достоверности;

tst - стандартное значение критерия;

V — число степеней свободы. Вычисляется :

Алгоритм: пь Vb VrM, (VrM)2 1- Vi VrM(VrM)2 2 - V2 V2-M (V2-

M)2

I)абсолютная длина хромосом в микронах — а® мк;

2)относительная длина хромосом — длина хромосомы от общей длины всех хромосом гаплоидного набора, выраженная в процентах — az%;

3)плечевой индекс - отношение длинного плеча к короткому; ) центромерный индекс — отношение длины короткого плеча к

длине всей хромосомы, выраженный в процентах - (jc%).

Измерение хромосом, определение их морфологии проводят, как правило, в клетках, обработанных колхицином, 8-оксихинолином, при воздействии которых хромосомы выпрямляются, укорачиваясь. При этом четко выявляются перетяжки хромосом как первичные, так и вторичные, хорошо видно хроматидное строение. В меристеме корешков, обработанных колхицином и другими веществами, идет постепенное накапливание метафазных пластинок, в которых хромосомы спирализованы разной степени. Поэтому при отборе

23

метафазных пластинок к-метафаз необходимо учитывать степень спирализации хромосом. Для этого вычисляется индекс спирализации хромосом данной пластинки — отношение длины двух самых крупных хромосом к двум наименьшим. 1ндекс спирализации является критерием степени спирализации хромосом в разных метафазных пластинках. Рекомендуется брать хромосомные наборы с несильно укороченными хромосомами и с одинаковой степенью пирализации, близкой к степени спирализации необработанных гетафазных пластинок

Для подсчета хромосом и проведения кариотипирования на приготовленных давленных препаратах необходимо отобрать - метафазные ластинки, которые должны отвечать следующим требованиям:

- максимальная окраска хромосом на фоне бесцветной или слабо крашенной цитоплазмы;

-препарат не должен быть передавленным, оболочки исследуемых леток должны быть целыми, чтобы быть уверенными в наличии всех хромосом;

-необходимо вбирать пластинки, в которых хромосомы располагаются одной плоскости без наложения друг на друга.

Цель работы:

1 Ознакомиться с установкой света в микроскопе по методу Келера 2 Подсчитать число хромосом на приготовленных давленных

препаратах Задачи: Освоить установку света в микроскопе по Келлеру.

2.С готовых препаратов зарисовать хромосомные наборы следующих вдов: Crepis capillaris 2n “ 6 Crepis tectorum 2n = 8 Haplopa’ppus 2n = 4 scarfs 2n = 2 Ascaris 2n = 4. Обозначить гомологичные пары и типы юмосом. Для видов Crepis capillaris 2n ~ 6 и Ascaris составить гонограммы.

Материалы и оборудование.

-45% уксусная кислота -покровные стекла фильтровальная бумага предметные стекла осветительная лампа

микроскоп пророщенные семена культур

24

Ход работы: Приготовление препарата.

Окрашенный корешок помещается на предметное стекло в каплю 45% уксусной кислоты, отрезается темно окрашенная меристематическая часть, корешка остальная часть корешка удаляется. Корешок накрывается покровным стеклом. Покровное стекло сверху накрывают слоями фильтровальной бумаги и не сдвигая фильтровальную бумагу обратной стороной иглы располагают клетки в монослой. Затем придерживая покровное стекло круговым вращательным движением обратной стороной иглы уплощают клезуи.

Подсчет числа хромосом Для подсчета числа хромосом при малом увеличении на препарате

находят метафазные пластинки. Затем с объективом 40х определяют пригодность данной метафазы к анализу. При хорошем разбросе хромосом и их малом количестве подсчет можно проводить при этом же увеличении. Лучше всего подсчет проводить при использовании иммерсионных систем, когда четко выявляется морфология хромосом. При хорошем разбросе хромосом и их малом количестве можно проводить при этом же увеличении. Лучше всего подсчет проводить при использовании иммерсионных систем, когда четко выявляется морфология хромосом. При1 подсчете необходимо пользоваться микрометрическим винтом, чтобы лучше рассмотреть контуры хромосом. Подсчет проводится по секторам клетки с зарисовкой контуров хромосом на бумаге. После зарисовки всего комплекса проводят повторный анализ клетки, нумеруя каждую хромосому. Надо подсчитать хромосомы не менее, чем в 10 клетках. Если число хромосом в изученных клетках совпадает, его принимают за число хромосом данного организма. При сильных отклонениях выборку следует увеличить.

Лабораторная работа№5

Тема: Анафазный метод учёта перестроек хромосом

Теоретическая часть Аберрации хромосом и методы их учета. Различают следующие

логические эффекты под воздействием вредных факторов среды. Первый эффект - временное прекращение деления клетки

зрушаются какие-то вещества, играющие важную роль в митозе, или

25

вляются митотические яды, которые подавляют митоз). Восстановление отической функции клетки говорит о том, что это угнетающее вещество юдено из клетки или произошло восстановление веществ, важных для хождения митоза.

Второй эффект - воздействие на веретено деления, результатом которого является полиплоидизация клетки.

Третьим эффектом являются как точечные, так и структурные соединения хромосом.

Структурные изменения хромосом связаны с разрывом и соединением частей хромосом. Вначале происходит разрыв и образуются фрагменты со свободными связями. Второй этап - комбинация и закрытие свободных связей. Структурные изменения отличаются друг от друга в зависимости от того, на какой стадии этического цикла произошло вредное воздействие. Если на стадии Gi, до редупликации хромосом, когда хромосома представлена в виде эй нити, наблюдаются хромосомные разрывы. Если хромосома уже шлицирована и имеет две нити (стадия S или GSL), происходят датидные разрывы.

Перестройки хромосом изучаются в меристеме кончиков корешков на ии метафазы (метафазный метод) и на стадии анафазы (анафазный

>Д).

Наиболее совершенным является метафазный метод, т.к. он позволяет se точно установить типы перестроек хромосом и определить их 1чество. Но этот метод применим только в том случае, когда изучаемый жт имеет хорошо идентифицируемые хромосомы. Если же объект трудно различимые хромосомы, применяют анафазный метод учета устроя хромосом.

Типы аберраций хромосом, наблюдаемые, при анафазном методе. 1.Деления - потеря участка хромосом, возникновение

центрических (с громерой) и ацентрических (без центромеры) фрагментов.

Концевая делеция - потеря концевого участка хромосомы. В случае досомной делеции наблюдаются два фрагмента, лежащие параллельно друг от друга; в случае хроматидной делеции имеется одиночный фрагмент. Если имеется изохроматидная деления, т.е. повреждены концы обеих хроматид, то пару хроматидных фрагментов трудно

отличить от двойных хромосомных фрагментов.

Интерстициальная делеция - потеря внутреннего участка хромосомы.

26

При потере внутреннего участка одного плеча - параценгрическая делении - образуются кольцевые апеетрические фрагменты и микрофрагменгы. При перицешрической делеции, включающей центромерный район, образуется центрическое кольцо. В случае хромосомной делеции такое кольцо будет двойным с расположенными рядом двумя фрагментами, в случае хроматидной делеции - одиночное кольцо с одиночным фрагментом.

2.Транслокадия - обмен участками между двумя хромосомами. Симметричная транслокация - обмен ацентрическими участками одинаковой или разной длины. При анафазном анализе такие перестройки не обнаруживаются. При асимметричном обмене, когда происходит воссоединение центрических фрагментов, образуется диценгрик, хромосома с двумя центромерами и в анафазе мосты и фрагменты. В случае хромосомного асимметрического обмена возникают двойные мосты, перекрещенные или параллельные, лежащие близко друг к другу. При образовании хроматидных децентриков наблюдаются одиночные мосты (см. рис. 1).

Цель: изучить токсическое воздействие на растения (почва, снег, вода); ознакомиться с типами перестроек хромосом при анафазном методе.

Задачи; определить митотический индекс; подсчитать процент аберраций клеток на стадии анафазы.

Материалы и оборудование:

1.Микроскоп;

2.Осветитель;

3.Предметные стекла;

4.Покровные стекла;

5.Ацето кармин -100 мл;

6.Этиловый спирт 96° или абсолютный;

7.Ледяная уксусная кислота - 100 мл;

8.45% уксусная кислот - 100 мл;

9.Хлорал-гидрат - 20 г,

10.Препаровальные иглы - 20;

11.Чашки Петри - 20;

12.Фильтровальная бумага - 1 х 1 м;

13.Ножницы -10;

14.Дистиллированная вода - 500 мл;

15.Альбом для рисования - 10;

16.Карандаши простые - 10;

17.Циркуль-10;

27

18.Семена дука10 г,

19.КГ2СГ£ 0^ (бихромат калия) - 10 г. Ход работы:

Йемена лука 3-5-летнего хранения прорастить до появления

первого ггоза в меристеме корешков (0,5-0,8 см).

2.Корешки зафиксировать в фиксаторе 3 : 1 (смесь из трех частей 96° и одной части ледяной уксусной кислоты).

3.Приготовить временные ацетокарминовые давленные в хлорал-драте препараты корешков лука.

4.Провести анализ препарата: а) определить митотический индекс; б) посчитать отдельно по корешкам количество с нормальными анафазами и лофазами и количество клеток с перестройками, классифицируя каждую; занести данные в таблицу (1).

При анафазном методе анализа перестроек хромосом идентифицируют гетки с одиночными (-) и двойными (=) фрагментами

иклетки с обычными (С) и двойными (X) мостами. Мост отмечаются с фрагментами без них и относятся к разным типам (С^С-.Х-Д^).

В таблице использованы следующие обозначения: - анафазная клетка с одиночным микрофрагментом

- анафазная клетка с двумя независимыми аберрациями /шкрофрагментом и фрагментом)

- анафазная клетка с двойным фрагментом ; - авафазвая клетка с одиночным мостом ; - авафазвая клетка с двойным мостом \

- анафазная клетка с отставшими хромосомами \ - аУв - дробь: в числителе - количество клеток с данными

аберрациями, знаменателе - количество аберраций в клетке.

В клетке может быть несколько разных типов перестроек хромосом. В гом случае аберрацию для удобства отделяют кругом.

5.После анализа препаратов проводится подсчет общего количества проанализированных клеток и определяется: ^

А) процент клеток с аберрациями (отношение числа клеток с беррациями к общему числу клеток, умноженное на 100);

Б) количество аберраций в пересчете на 1 клетку (отношение общего :ис л а аберраций к общему числу клеток);

, В) для анализа спектра аберрации таким же образом (как в п. 2) 1ысвечивают количество аберраций каждого типа в расчете на число проанализированных клеток;

Г) доля аберраций определенного типа от числа всех аберраций; Д) поврежденность аберрационной клетки, в % .

28

6.Сравнение с контролем;

7.Выводы.

Лабораторная работа №6

Тема: «Методы учета индуцированных микроядер в животных и растительных клетках (микроядерный тест)»

Цель работы: оценить степень воздействия вредных факторов в опытной и контрольной группе при помощи сравнения числа микроядер в животных и растительных клетках.

1.Метод определения частоты встречаемости полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге

мышей и крыс. Теория.

Метод предложен Heddle и Schmid в начале 70-х гг. Во время деления клеток ацентрические фрагменты хромосом и отставшие хромосомы, не вошедшие в дочерние ядра, формируют в цитоплазме клеток одно, реже два ДМК-содержащих образования, получивших название микроядер. Т.о. это учет частоты клеток с микроядрами указывает на цитогенетическую активность изучаемого фактора. Самый надежный результат дает подсчет микроядер в созревающих эритроцитах костного мозга - полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ). Дифференциальное окрашивание позволит легко отличить эти недавно прошедшие митоз клетки от зрелых эритроцитов. Ретикулоциты лишены ядра, имеют размеры и форму эритроцитов, но цитоплазма серовато-голубого цвета. Уже безъядерные, но еще содержащие базофильную субстанцию эритроциты (ретикулоциты) находятся в костном мозге около 24 часов, после чего выходят периферическую кровь, где завершается их созревание. В соответствии с этой динамикой эритропоэза, микроядра в эритроцитах появляются через несколько часов после однократного воздействия мутагена, затем

29

их частота достигает максимума, а затем снижается до контрольного уровня. При этом в зрелых эритроцитах уровень микроядер не повышается за эти сроки. Полученные экспериментальные данные показали, что в подострых опытах выявляется. Максимальная цитогенетическая эффективность вещества. При этом снижается количество временных после окончания воздействия временных факторов и оценивается накопление первичных повреждений ^ia протяжении всего клеточного цикла. В связи с этим на этапе выявления мутагенов рекомендовано для микроядерного теста -двукратное введение вещества за 30 и 6 часов до забоя (т.е. вещество вводят дважды с интервалом в 24 часа), через в часов после последнего введения производят забор материала.

Эксперименты проводят на белых нелинейных мышах или крысах. Масса мыши -18-20 г. Масса крысы - 180-200 г.

Материалы и оборудование: водяная баня или термостат на 60 °(\ центрифуга, холодильник, секундомер, стеклянные стаканчики, чашки Петри, пипетки, центрифужные пробирки, предметные стекла, маленькиеножницы, глазной пинцет, марля (для очистки костей), шприц на 1-2мл.

Реактивы: смесь 0,1%-ного раствора азура и 0,1%-ного раствора эозина * дистиллированной водой (бОмлазура, 30мл эозина, 100мл воды), краси к-ш, Май-Грюнвальд, 1%-ный раствор цитрата натрия.

Ход работы. Изучение мутагенного эффекта химических веществ и микроядерном тесте проводится в остром опыте. Вещество вводится зои лом внутрижелудочно 2-кратно с интервалом между введениями 24 часа. Забой животных проводится через 6 часов после последнего введения. Обычно исследуются 4 дозы в интервале 0,2 - 0,002. Контрольным животным вводится растворитель. На группу берется минимум по 6 животных. После забоя готовят препараты из суспензии клеток костного мозга и анализируют их под микроскопом, результаты заносят в таблицу, затем статистически обрабатывают.

Приготовление препаратов из суспензии клеток костного мозга. Животных забивают смещением шейных позвонков; выделяют

бедренные кости (у крыс - одну кость) и очищают марли от мышц. Отрезают верхний конец бедренной кости так, чтобы было видно отверстие канала кости. I \ центрифужные пробирки наливают 1%-ный раствор цитрата натрия. Набирают в шприц 0,2-0,5 мл цитрата натрия из пробирки и, вставив иглу шприца в канал кости, вымывают костный мозг в пробирку. Эту процедуру повторяют 2-3 раза. Пробирки с суспензией клеток центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.

30

Супернатанат отсасывают, осадок ресуспензируют пи¬ петкой до получения гомогенной суспензии. Каплю суспензии пастероы КИЙ пипеткой наносят на конец сухого обезжиренного стекла и другим стеклом делают мазок. После высушивания на воздухе мазок окрашивают по следующей методике: мазок фиксируют в метаноле в течение 3-х минут; наносят на мазок азур-эозин на40мин.; препараты дважды промывают водой; наносят на стекло неразведенный краситель Май-Грюнвальда - 3 мин.; препарат промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Анализ препаратов. Анализ проводят под микроскопом с использованием иммерсионного объектива 10x90. Пригодными для анализа считаю п и препараты с хорошо расправленными эритроцитами, поверхность котры не имеет выростов и складок. ПХЭ имеют серовато-голубоватую окрас и нормохромные - оранжеворозовую. Микроядра представляют собой округлые, с четкой границей образования, имеющие темную окрас и сходную с окраской ядер в препарате. Анализ проводят на зашифрованных препаратах, Насчитывают 1000 ПХЭ и определяют количество ПХЭ с микроядрами (МЯ). У интактных животных количество ПХЭ с МЯ колеблется от О до 5 на 1000 ПХЭ. Средний уровень ПХЭ с МЯ у беспородных мышей - самцов составляет 0,2±0,2%.

Таблица