Изоэлектрическая точка белков

Длинная полипептидная цепь белка на концах имеет только две ионизированные группы молекул. В боковых же группах полипептидных цепей макромолекул белков находится большое число ионогенных групп, которые способны диссоциировать в воде по следующей схеме:

-R-COOH -R-COO^- + H⁺ (1)

-R-NH₃OH -R-NH₃⁺ + OH^- (2)

Именно боковые группы макромолекул создают условия для образования ДЭС.

Знак и значение -потенциала и -потенциала будут определяться свойствами среды. В кислой среде подавляется диссоциация карбоксильных групп равновесие реакции (1) смещается в левую, а равновесие реакции (2) – в правую сторону. Макромолекулы белка будут нести избыточный положительный заряд и становятся поликатионами, -потенциал становится больше нуля (>0).

В щелочной среде, при избытке анионов ОН^- подавляется диссоциация основных групп, равновесие реакции (2) смещается в левую сторону, а равновесие реакции (1) – в правую. Макромолекула белка приобретает отрицательный заряд (<0) и превращается в полианион.

При помощи рН среды можно изменять ионизирующую способность макромолекул белков. Константы диссоциации кислотных и основных групп белков не совпадают  число диссоциированных основных и кислотных групп макромолекул белка может быть одним и тем же только при определенном значении рН среды. Такое состояние соответствует изоэлектрической точке (ИЭТ), т.е. значению рН среды, при котором число ионизированных основных групп равно числу ионизированных кислотных групп.

В ИЭТ противоионы полностью компенсируют заряд потенциалообразующего слоя, и -потенциал становится равным нулю.

ИЭТ белков лежит в пределах рН от 2 (у пепсина) до 10,6 (у цитрохрома С), но преимущественно ИЭТ белков соответствует рН<7.

РН водного раствора белков определяет конформационное состояние их макромолекул, которое в свою очередь влияет на такие свойства этих растворов, как вязкость и набухание.

П ри значении рН, равном или близком к ИЭТ, разноименно заряженные группы NH⁺₃ и СОО^- могут притягиваться друг к другу и закручивать макромолекулу в клубок и даже в глобулу (ИЭТ, рис. 5).

При рН, смещенном по отношению к ИЭТ, подавляется диссоциация некоторых функциональных групп; в кислой среде – карбоксильных групп (уравнение (1), в щелочной среде – аминогрупп (уравнение (2). В результате остаются одноименно заряженные группы молекул, которые отталкиваются, вследствие чего макромолекулы выпрямляются (области  или ).

В ИЭТ свойства растворов белков меняются: свертывание макромолекул в клубок снижает вязкость раствора до минимума (см. рис. 5, кривая 2). После выпрямления макромолекулы (области  или ) оказывают большее сопротивление течению жидкости и коэффициент вязкости  (и вязкость) растет. Такую же зависимость от рН среды имеет и степень набухания . В ИЭТ некоторые белки имеют наименьшую растворимость и максимальную способность к рассеянию света.

Порядок выполнения работы

Раствор белка – казеина – устойчив только в определенной области рН. При приближении к изоэлектрической точке раствор казеина становится все менее и менее устойчивым, что выражается в выпадении его в осадок. Наибольшее количество осадка выпадает при изоэлектрической точке. На этом основан описываемый ниже метод определения изоэлектрической точки казеина.

0,2 г казеина растворяют при нагревании на водяной бане до температуры 40 – 50⁰ в 5 мл 1 н. (с(СН₃СООNa) = 1 моль/л). Если растворения не наступает, то добавляют немного воды. Полученный слегка опалесцирующий раствор выливают в мерную колбу емкостью 50 мл и, доводя дистиллированной водой до метки, получают раствор казеина в 0,1 н. растворе ацетата натрия.

По 1 мл этого раствора наливают в девять пробирок, в которые предварительно налита вода и уксусная кислота в количествах, указанных в таблице.

Через 5 минут отмечают, в каких пробирках произошло помутнение или выпал осадок. Результаты опытов записывают в таблицу.

№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Дистиллированная вода, мл	8,38	7,75	8,75	8,5	8	7	5	1	7,4
0,01 н. уксусная кислота, мл	0,62	1,25	-	-	-	-	-	-	-
0, 1 н. уксусная кислота, мл	-	-	0,25	0,5	1	2	4	8	-
1 н. уксусная кислота, мл	-	-	-	-	-	-	-	-	1,6
Раствор казеина	1	1	1	1	1	1	1	1	1
рН раствора	5,9	5,6	5,3	5,0	4,7	4,4	4,1	3,8	3,5
А, оптическая плотность раствора
Степень хлопьеобразования

В последнюю строку таблицы заносят полученные результаты. Помутнение обозначено знаком «+», хлопьеобразование показано знаком «Х». Чем больше помутнение, тем больше знаков. Наибольшая коагуляция наблюдается в изоэлектрической точке.

Описанный метод определения изоэлектрической точки казеина является косвенным. Его можно проверить путем электрофореза, наблюдая за движением границы раствора казеина – ацетатный буфер того же состава. За передвижением границы можно проследить из-за раствора мутности казеина при условии хорошего освещения прибора сбоку. Измерения производятся с растворами 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9. Изоэлектрическая точка находится по графику u = f(pH) как точка пересечения кривой оси абсцисс.

Изоэлектрическую точку казеина можно также определить с помощью фотоколориметра. Часть содержимого каждой пробирки залить до метки в одну из фотокювет (l = 0,5 см), в другую кювету – дистиллированную воду. Установить длину волны  = 490 нм, установить «0» по воде и вести оптические определения по нижней шкале фотоколориметра (в долях от 1). Построить график А = f(рН), «излом» на графике соответствует изоэлектрической точке.

Контрольные вопросы

1. Образование двойного электрического слоя (ДЭС). Перечислить три механизма.

2. Строение ДЭС.

3. Факторы, влияющие на -потенциал.

4. Особенности белковых веществ как коллоидов: строение ДЭС в кислой и щелочной средах.

5. Обоснование возможности разделения белков электрофорезом.

6. Изоэлектрическая точка белков.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Зимон А.Д. Коллоидная химия. М.: Агар, 2001. 320 с.

2. Мушкамбаров Н.Н. Физическая и коллоидная химия. М.: Геотар-мед, 2001. 380 с.

3. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия. М.: Высш. шк., 1992. 414 с.

4. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. Л.: Химия, 1984. 300 с.

5. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсные системы. М.: Химия, 1982. 400 с.

6. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. Л.: Химия, 1984. 300 с.

7. Фролов Ю.Г., Гродский А.С. Лабораторные работы и задачи по коллоидной химии. М.: Химия, 1986. 216 с.

13