Готові розчини контролюють на вміст діючої речовини, рН.

Завдання на виконання

1. Приготувати сироп шипшини:

Склад:

Водний концентрат шипшини – 40 г

Опис. Сироп шипшини – густа сиропоподібна рідина червоно-коричневого кольору без зважених часточок, кисло-солодкого смаку з характерним запахом плодів шипшини. В готовому препараті вміст сухих речовин71 – 73%, аскорбінової кислоти – не менше 4 мг в 1 мл, цукру не менше 50%, густина 1,37.

Приготування. Зважують на вагах розраховану кількість плодів шипшини (10 г), проводять екстрагування гарячою водою(температура 70 – 75°С) (90 мл). Настоювання проводять при перемішуванні протягом60 хв. Витяжка містить багато пектинових речовин, які необхідно видалити. Пектинові речовини видаляють ензиматичним шляхом, додаючи фермент пектиназу у кількості1 – 1,25 г протягом 1 год (ферментацію проводять при температурі 43 – 45°С). Витяжку після ферментації фільтрують і упарюють під вакуумом(не більше 1 год). Втрати аскорбінової кислоти при цьому не більше4%. Згущений водний концентрат змішують з інвертованим цукровим сиропом(для стабілізації аскорбінової кислоти).

Приготування інвертованого цукрового сиропу. Зважують на вагах57,6 г

цукру, переносять у фарфорову чашку та додають32,4 г води (64% цукровий сироп) і після додавання 0,48 г винної чи лимонної кислоти(з розрахунку на 600 г цукру необхідно взяти 5 г винної кислоти) нагрівають протягом 30 хв при температурі 90°С. За цей час 30 % цукру інвертується. Після охолодження до 50

– 60°С сироп фільтрують і порціями змішують зі згущеним водним концентратом шипшини.

Контроль якості. В готовому сиропі шипшини визначають густину, вміст сухих речовин, аскорбінової кислоти, цукру.

2.Скласти технологічну схему отримання сиропу шипшини. Провести аналіз готового продукту.

3.Приготувати 20 мл розчину ацетату свинцю основного при взаємодії оксиду свинцю з ацетатом свинцю.

Опис. Безбарвна прозора або з незначним білим осадом рідина зі слабкою лужною реакцією. Густина 1,225 – 1,230. Застосовується як в’яжучий засіб для обмивання та примочок у вигляді2%-ого водного розчину, входить також до складу деяких мазей (свинцова мазь та мазь від пролежнів).

Склад.

Ацетату свинцю – 30 г

Окису свинцю – 10 г Води дистильованої до 100 мл.

Приготування. Розчин ацетату свинцю основного (свинцовий оцет, 17%-ий водний розчин основного ацетату свинцю складу[2Pb(CH3COO)2]×Pb(OH)2. Ацетату свинцю, оксиду свинцю, розтерті в ступці до дрібного стану, та 30 мл

70

гарячої свіжопрокип’яченої дистильованої води поміщають у колбу місткістю 200 мл і ретельно перемішують протягом30 хв до утворення білої маси. Після закінчення взаємодії до суміші додають наступну кількість гарячої свіжопрокип’яченої дистильованої води (що залишилась) і знову ретельно перемішують протягом 5 хв. Рідину переносять у невеликий флакон або колбу з пробкою і залишають до наступного заняття.

Через 1 тиждень рідину фільтрують через складчастий фільтр в сухий флакон, прикриваючи воронку склом для захисту від доступу вуглекислого газу, щоб не утворилися основні солі карбонату свинцю, майже нерозчинні у воді. Далі прозорий розчин зважують, вимірюють об’єм, визначають густину, і, за необхідності, додають свіжопрокип’ячену дистильовану воду до густини1,223

–1,230. Вміст свинцю в препараті має складати 16,7 – 17,4%.

4.Накреслити схему технологічного процесу одержання розчину ацетату свинцю основного. Здійснити аналіз готового розчину.

5.Приготувати 10 мл 5%-ого спиртового розчину йоду. Здійснити аналіз готового розчину: тотожність, відсотковий вміст спирту за показником заломлення.

Приготування. Для приготування 5%-ого розчину йоду беруть20 вагових частин калію йодиду, 50 вагових частин кристалічного йоду, води і спирту 95° порівну до 1000 об’ємних частин. У колбу вміщують кристалічний йод, калію йодид і подвійну кількість по відношенню до калію йодиду води дистильованої. В концентрованому розчині калію йодиду розчиняється значна кількість кристалічного йоду. Потім додають приблизно 1/5 спирту етилового і перемішують протягом 15 хв до повного розчинення всіх компонентів. Додають спирт, що залишився, і невеликими порціями – воду, що залишилась. Розчин відстоюють і фільтрують.

6.Накреслити схему технологічного процесу одержання розчину йоду.

7.Приготувати 25 мл 40% розчину глюкози. Скласти робочий пропис. Розчин зберігати до наступного заняття.

Приклад розрахунку. Приготувати 500 мл 40% розчину глюкози. Скласти робочий пропис.

За відсутності глюкози сорту«для ін’єкцій» розчин готують дещо більшої концентрації (на 0,5 – 1%). Для одержання 500 мл 41% розчину глюкози необ-

кристалізаційної води в препараті розраховують за формулою:

71

х = а ´100 = 205´100 = 228г 100 - б 100 -10

а – кількість безводної глюкози в г; б – відсотковий вміст води в препараті за результатом аналізу(наприклад,

10%).

Для стабілізації розчину глюкози додають0,26 г хлориду натрію та5 мл 0,1 н хлористоводневої кислоти на кожний літр розчину. З метою руйнування пірогенних речовин хлорид натрію вносять у чашки Петрі(товщина шару 6 – 7 см) і нагрівають в сушильній стерилізаційній шафі при 180°С – 2 год і використовують протягом 24 год.

Для зручності роботи заздалегідь готують стерильний розчин стабілізатора

Вказаний стабілізатор додають у кількості5% від загального об’єму глюкози незалежно від її концентрації.

До 500 мл розчину глюкози необхідно додати стабілізатора:

ін’єкцій до мітки 500 мл.

За відсутності мірного посуду точний об’єм води розраховують, використовуючи коефіцієнт збільшення об’єму або шляхом переведення об’єму розчину в масу. Коефіцієнт збільшення об’єму для водної глюкози складає0,69 мл/г. При розчиненні 228 г об’єм розчину збільшується на х мл:

Необхідний об’єм води розраховують за різницею: 500 – 157 = 343 мл. Густина 40% розчину глюкози 1,1498. Маса 500 мл 40% розчину глюкози:

500 × 1,1498 = 575 г. Необхідний об’єм води визначають за різницею:

Контрольні запитання

1.Яка апаратура використовується при одержанні розчинів?

2.Які типи перемішуючих пристроїв використовуються при одержанні розчинів, принцип їх роботи?

72

3.Які фільтри використовуються для очищення розчинів?

4.Скільки води необхідно додати до1,2 л кислоти оцтової, густина якої 1,060 при температурі 23ºС, щоб приготувати 30%-ий розчин?

5.Одержано 240 мл розчину основного ацетату алюмінію густиною 1,050. Скільки необхідно додати води, щоб одержати препарат густиною 1,048?

6.За стехіометричним рівнянням розрахувати кількість галуна необхідного для отримання 150 частин розчину основного ацетату алюмінію хімічним способом.

7.Перерахуйте способи підготовки води очищеної та води для ін’єкцій.

8.За якими показниками контролюють якість ін’єкційних розчинів?

9.При перевірці термічної стійкості100 ампул з однієї партії24 виявилися пошкоджені (лопнули). Чим пояснюється низька міцність ампул і чи можливо її підвищити?

10.В ампулах з розчином глюкози з однієї серії частина ампул містить прозорий розчин, інша частина – розчин з явно вираженим жовтуватим відтінком. В окремих ампулах зустрічаються сторонні включення, які мають вигляд чорних пластівців різноманітної величини і форми. Чим можна пояснити зазначені явища? В чому полягає дефект роботи і як цьому можна запобігти?

11.Які особливості приготування неводних розчинів, номенклатура?

12.Склад отримав 202,96 л 96,5° етанолу при 0ºС. Визначити об’єм безводного етанолу за нормальних умовах (20ºС).

13.Які види сиропів використовуються в медичній практиці?

14.Якими способами можна отримати звичайний цукровий сироп?

15.За якими показниками характеризують якість лікарських сиропів?

73

Лабораторна робота № 7

МЕТОДИ МІКРОБІОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ (ПОЧАТОК). (4 год)

Мета роботи: ознайомлення з методами мікробіологічного контролю лікарських засобів (визначення мікробіологічної чистоти та стерильності лікарських засобів).

Матеріали та обладнання: таблетки не покриті оболонкою; розчини для ін’єкцій заводського виробництва; розчини та сиропи, що виготовили студенти; стерильні чашки Петрі з агаризованим середовищем(МПА, Сабуро, Ендо, ВСА, №9 та №10); стерильні рідкі поживні середовища у пробірках (№3 та №8) по 10 мл; стерильні агаризовані середовища МПА та Сабуро у пробірках по4 – 5 мл; пробірки зі стерильним фосфатним буфером по10 мл; спиртівки; стерильні ступки з пестиками; шпателі Дригальського, стерильні піпетки об’ємом 1, 2 см3; термостат.

Загальні відомості Дослідження на стерильність.

Випробування на стерильність проводять для контролю субстанцій, готових лікарських засобів або виробів, які відповідно до вимог Фармакопеї мають бути стерильними. Однак задовільний результат аналізу означає лише те, що в умовах випробування у зразку не були виявлені життєздатні мікроорганізми.

Для проведення випробування на стерильність можуть бути використані живильні середовища: рідке тіогліколеве середовище (призначене для вирощування бактерій), середовище Сабуро (для вирощування грибів).

Випробування методом мембранної фільтрації. Використовують мем-

бранні фільтри з номінальним розміром пор не більше0,45 мкм, здатні ефективно затримувати мікроорганізми. Для водних, розведених спиртових розчинів та розчинів в оліях, наприклад, використовують целюлозно-нітратні мембранні фільтри, а для концентрованих спиртових розчинів– целюлозно-ацетатні мембранні фільтри. Якщо необхідно, для деяких лікарських засобів, наприклад, для антибіотиків, можуть бути використані спеціальні мембранні фільтри.

Використовують мембранні фільтри діаметром близько50 мм. При використанні мембранних фільтрів іншого діаметра об’єм розчинника і промивної рідини змінюють відповідним чином. Фільтраційну установку і мембранні фільтри стерилізують підхожим способом. Конструкція фільтраційної установки має забезпечувати асептичні умови при внесенні й фільтрації лікарського засобу, а також при видаленні мембранного фільтра для перенесення його у живильне середовище або має дозволяти проводити інкубацію посівів безпосередньо в самій установці після додавання в неї живильного середовища.

Водні розчини. Перед початком випробування рекомендується пропустити крізь мембранний фільтр невелику кількість підхожого стерильного розчинника, наприклад, нейтрального розчину 1 г/л м’ясного або казеїнового пептону з

74

рН 7,1±0,2. Розчинник може містити відповідні нейтралізатори і/або відповідні інактиватори, наприклад, при випробуванні антибіотиків.

Увесь вміст контейнера(ів) з випробовуваним зразком переносять на мембранний фільтр або мембранні фільтри. Якщо необхідно, попередньо доводять об’єм зразка до 100 мл відповідним стерильним розчинником. Негайно фільтрують. Якщо лікарський засіб має антимікробну активність за умов випробування, мембранний фільтр відмивають не менше трьох разів, пропускаючи крізь нього при кожному відмиванні той самий об’єм обраної стерильної промивної рідини, що і при перевірці придатності методики. Після відмивання мембранний фільтр переносять у живильне середовище або розрізають його, дотримуючись правил асептики, на дві рівні частини, кожну з яких поміщають у відповідне живильне середовище. При використанні установки закритого типу живильне середовище вносять безпосередньо в установку. Якщо немає інших зазначень в окремій статті, посіви інкубують не менше 14 діб при температурі від 30°С до 35°С (живильні середовища, призначені переважно для виявлення бактерій) і при температурі від 20°С до 25°С (живильні середовища, призначені переважно для виявлення грибів).

Тверді розчинні речовини. Кількість лікарського засобу, взята для висівання на кожне живильне середовище, має бути не менше зазначеної у Табл. 7.1. Зразок розчиняють у підхожому розчиннику, наприклад, нейтральному розчині 1 г/л м'ясного або казеїнового пептону, і проводять випробування, як описано для водних розчинів, використовуючи тип мембранних фільтрів відповідно до вибраного розчинника.

Олії і розчини в оліях. Кількість лікарського засобу, взята для висівання на кожне живильне середовище, має бути не менше зазначеної у Табл. 7.1. Олії і розчини олій з досить малою в’язкістю допускається фільтрувати крізь сухий мембранний фільтр без попереднього розведення. В’язкі олії, якщо необхідно, розчиняють у підхожому стерильному розчиннику, наприклад, в ізопропілміристаті, який не має антимікробної активності за умов випробування. Дають можливість олії проникнути в пори мембранного фільтра самопливом, а потім фільтрують, використовуючи тиск, або вакуум. Мембранний фільтр відмивають не менше трьох разів, пропускаючи крізь нього щоразу близько 100 мл відповідної стерильної промивної рідини, наприклад, розчину 1 г/л м’ясного або казеїнового пептону, що містить 10 г/л полісорбату-80 або підхожу кількість іншого емульгатора, що не має антимікробної активності за умов випробування. Мембранний фільтр або мембранні фільтри поміщають у живильне середовище або живильні середовища, або вносять живильне середовище або живильні середовища у фільтраційну установку й інкубують, як описано для водних розчинів.

Мазі і креми. Кількість лікарського засобу, взята для висівання на кожне живильне середовище, має бути не менше зазначеної у Табл. 2.6.1.-2. Мазі на жировій основі та емульсії типу вода/олія допускається розводити ізопропілміристатом у співвідношенні 1:100, як описано вище, використовуючи, якщо необхідно, нагрівання до температури не більше40°С. У виняткових випадках допускається нагрівання до температури не більше 44°С. Фільтрацію проводять

75

негайно з максимально можливою швидкістю. Далі випробування проводять, як описано вище для олій і розчинів в оліях.

Випробування методом прямого висівання. Випробовуваний лікарський за-

сіб вносять безпосередньо у живильне середовище у кількості, зазначеній у Табл. 7.1. Якщо немає інших зазначень в окремій статті, кількість лікарського засобу має становити не більше 10 % від об’єму живильного середовища.

У тому випадку, коли лікарський засіб має антимікробну активність за умов випробування, її нейтралізують шляхом додавання підхожих нейтралізаторів або збільшення об’єму живильного середовища. Якщо для висівання необхідно використати велику кількість зразка, краще застосовувати концентроване живильне середовище, приготоване з урахуванням наступного розведення. Там, де це можливо, концентроване живильне середовище рекомендується додавати безпосередньо в контейнер з лікарським засобом.

Рідини, що містять олії. У живильне середовище попередньо додають10 г/л полісорбату або підхожу кількість іншого емульгатора, що не має антимікробної активності за умов випробування.

Мазі і креми. Лікарський засіб емульгують у розведенні 1:10 за допомогою підхожого емульгатора в підхожому стерильному розчиннику, наприклад, нейтральному розчині 1 г/л м’ясного або казеїнового пептону. Одержану емульсію вносять у живильне середовище, яке не містить емульгатора.

Якщо немає інших зазначень в окремій статті, посіви інкубують не менше 14 діб. Посіви переглядають кілька разів у період інкубації. Посіви олійних лікарських засобів щодня акуратно струшують. Однак у тому випадку, коли тіогліколеве або аналогічне йому середовище застосовується для виявлення анаеробних мікроорганізмів, струшування або перемішування має бути зведене до мінімуму для того, щоб не порушувати анаеробних умов.

Контроль стерильності парентеральних, офтальмологічних і інших не

ін’єкційних готових лікарських засобів, до яких ставляться вимоги щодо стерильності. При випробуванні методом мембранної фільтрації використовують, якщо це можливо, увесь вміст контейнера, але не менше кількості, зазначеної у Табл. 7.1. Якщо необхідно, доводять об’єм зразка до 100 мл відповідним стерильним розчинником, наприклад, нейтральним розчином 1 г/л м’ясного або казеїнового пептону. Якщо немає інших зазначень в окремій статті, загальний об’єм, що пропускається крізь один мембранний фільтр, не має перевищувати

1000 мл.

76

При випробуванні методом прямого висівання використовують зразок у кількостях, зазначених у Табл. 7.1. Із кожного контейнера проводять висівання на середовище для виявлення бактерій і на середовище для виявлення грибів. Утому випадку, якщо об’єм або кількість лікарського засобу в одному контейнері недостатня для проведення випробування, використовують вміст двох і більше контейнерів для висівання на різні живильні середовища. Якщо об’єм вмісту одного контейнера перевищує100 мл, використовують метод мембранної фільтрації, якщо немає інших зазначень в окремій статті.

Випробування мікробіологічної чистоти нестерильних лікарських засобів (визначення загального числа життєздатних аеробних мікроорганізмів).

Випробування, описані нижче, дозволяють здійснювати кількісне визначення мезофільних бактерій та грибів, здатних рости за аеробних умов. Випробування призначені насамперед для того, щоб визначити, чи задовольняє субстанція вимогам щодо мікробіологічної чистоти, наведеним в окремій статті.

Випробування проводять за умов, що дозволяють запобігти випадковому мікробному забрудненню випробовуваного зразка. Заходи, що вживаються для запобігання мікробному забрудненню випробовуваного зразка, не мають впливати на мікроорганізми, які можуть бути виявлені при проведенні випробування. У випадку, якщо випробовуваний лікарський засіб виявляє антимікробну активність, вона має бути підхожим чином нейтралізована. При використанні з

77

цією метою інактиваторів треба підтвердити їхню нейтралізуючу ефективність і нешкідливість для мікроорганізмів.

Визначення загального числа аеробних мікроорганізмів проводять методом мембранної фільтрації або методом висівання на чашки Петрі.

Підготовка зразка

Порядок відбору проб. Відбір проб лікарського засобу треба проводити в суворо визначеному порядку. Порядок відбору проб залежить від розмірів серії, ступеня небезпеки для здоров’я, пов’язаної з мікробним забрудненням лікарського засобу вище допустимого рівня, характеристиками лікарського засобу й очікуваним рівнем мікробного забруднення. Якщо немає інших зазначень в окремій статті, для випробування використовують зразки по 10 г або 10 мл субстанції або готового лікарського засобу, відібрані з дотриманням застережних заходів, як зазначено вище. Зразки відбирають у випадковому порядку з упаковок in bulk або з контейнерів з готовим лікарським засобом. Якщо необхідно, при відборі однієї проби змішують вміст кількох контейнерів, для того щоб одержати зразок необхідної маси або об’єму(залежно від природи випробовуваної субстанції або готового лікарського засобу).

Прикладом плану відбору проб є трирівневий порядок пробовідбору, використовуваний для лікарських засобів, у яких велика ймовірність нерівномірного розподілу мікроорганізмів. У цьому випадку від кожної серії відбирають п’ять зразків, кожний з яких випробовують окремо.

Лікарські засоби, розчинні у воді. 10 г або 10 мл випробовуваного лікарсь-

кого засобу розчиняють або розбавляють буферним розчином із натрію хлоридом і пептоном рН7,0 або іншою підхожою рідиною. Як правило, використовують розведення 1:10. Якщо необхідно, допускається використання інших розведень відповідно до властивостей лікарського засобу або до вимог щодо чутливості методики. Якщо відомо, що лікарський засіб виявляє антимікробну активність, до розчинника може бути доданий інактиватор. Якщо необхідно, доводять рН розчину приблизно до 7 і готують подальші десятикратні серійні розведення, використовуючи той самий розчинник.

Нерозчинні у воді лікарські засоби, що не містять жирів. 10 г або 10 мл випробовуваного лікарського засобу суспендують у буферному розчині з - на трію хлоридом і пептоном рН7,0 або в іншій підхожій рідині. Як правило, готують суспензію у розведенні1:10. Якщо необхідно, допускається збільшення об’єму розчинника відповідно до властивостей лікарського засобу. Для суспендування погано змочуваних субстанцій до буферного розчину може бути додана підхожа поверхнево-активна речовина, наприклад, полісорбат-80 у концентрації 1 г/л буферного розчину. У тому випадку, коли відомо, що лікарський засіб виявляє антимікробну активність, до розчинника може бути доданий інактиватор. Якщо необхідно, доводять рН розчину приблизно до 7 і готують подальші десятикратні серійні розведення, використовуючи той самий розчинник.

Лікарські засоби, що містять жири. 10 г або 10 мл випробовуваного лі-

карського засобу гомогенізують із стерильним полісорбатом-80 або іншою підхожою стерильною поверхнево-активною речовиною в кількості, що не перевищує половину маси випробовуваного зразка. Якщо необхідно, допускається

78

попереднє підігрівання поверхнево-активної речовини до температури не більше 40°С. У виняткових випадках допускається нагрівання до температури не більше 45°С. Ретельно перемішують, якщо необхідно, підтримуючи температуру за допомогою водяної бані або термостата. Додають буферний розчин з натрію хлоридом і пептоном рН7,0, попередньо підігрітий до відповідної темпе-

ратури, у кількості, необхідній для одержання розведення вихідного зразка 1:10. Ретельно перемішують, підтримуючи температуру протягом мінімального часу, необхідного для утворення емульсії, але у будь-якому разі не більше30 хв. Подальші серійні десятикратні розведення готують, використовуючи буферний розчин із натрію хлоридом і пептоном рН7,0, що містить підхожу концентрацію стерильного полісорбату-80 або іншої стерильної поверхнево-активної речовини.

Трансдермальні пластирі. Десять пластирів звільняють від захисного покриття (знімних прокладок) за допомогою стерильного пінцета й поміщають у стерильні пластмасові або скляні лотки клейкою поверхнею догори. Якщо необхідно, клейку поверхню покривають стерильною марлею(або сіткою з полімерного моноволокна типу тканинного фільтра) і переносять десять пластирів у посудину, що містить не менше 500 мл буферного розчину з натрію хлоридом і пептоном рН 7,0 і підхожі інактиватори, наприклад, полісорбат-80 і/або лецитин. Енергійно струшують не менше 30 хв (зразок А). Іншу групу з десяти пластирів готують, як описано вище, поміщають у посудину, що містить не менше 500 мл рідкого живильного середовища, і енергійно струшують не менше 30 хв (зразок В).

Випробування зразка Метод мембранної фільтрації. Використовують мембранні фільтри з роз-

міром пор не більше0,45 мкм, здатні ефективно затримувати мікроорганізми. Матеріал мембранного фільтра треба вибирати таким чином, щоб компоненти випробовуваного лікарського засобу не впливали на його ефективність. Целю- лозно-нітратні фільтри, наприклад, можуть бути використані для водних, розведених спиртових розчинів і розчинів в оліях, а целюлозно-ацетатні фільтри – для концентрованих спиртових розчинів. Конструкція фільтраційної установки має дозволяти проводити перенесення мембранного фільтра на живильне середовище.

Підхожу кількість зразка, підготовану, як описано у розділі«Підготовка зразка» (відповідну 1 г випробовуваного лікарського засобу або меншій його кількості, якщо очікується високий ступінь мікробної забрудненості), переносять на кожний із двох мембранних фільтрів і негайно фільтрують. Кожний мембранний фільтр відмивають трьома порціями, близько 100 мл кожна, підхожої рідини, наприклад, буферного розчину з натрію хлоридом і пептоном рН 7,0. До промивної рідини можуть бути додані поверхнево-активні речовини, наприклад, полісорбат-80 або інактиватори. Допускається використовувати для відмивання мембранних фільтрів менше трьох порцій промивної рідини за умови перевірки придатності методики. Мембранний фільтр, призначений переважно для підрахунку бактерій, поміщають на поверхню відповідного густого живильного середовища, наприклад, середовища МПА, а інший, призначений

79

переважно для підрахунку грибів, – на поверхню відповідного густого живильного середовища, наприклад, середовища Сабуро. Чашки з середовищем МПА інкубують при температурі від30°С до 35°С, чашки з середовищем Сабуро– від 20°С до 25°С протягом п’яти діб, якщо вірогідні результати випробування не будуть одержані за більш короткий час. Відбирають чашки, кількість колоній на яких не перевищує 100, і визначають число колонієутворюючих одиниць у грамі або мілілітрі лікарського засобу.

Метод висівання на чашки а. Метод глибинного висівання. У кожну чашку Петрі діаметром9 см вно-

сять 1 мл випробовуваного зразка, підготованого, як описано вище у розділі «Підготовка зразка», і від 15 мл до 20 мл розплавленого густого живильного середовища для вирощування бактерій(наприклад, середовище МПА) або від 15 мл до 20 мл розплавленого густого живильного середовища для вирощування грибів (наприклад, середовище Сабуро). Температура живильного середовища має становити не більше45°С. При використанні чашок Петрі більшого діаметра відповідно збільшують кількість живильного середовища. Для кожного розведення використовують не менше двох чашок Петрі з кожним живильним середовищем. Посіви інкубують при температурі від30°С до 35°С (від 20°С до 25°С для грибів) протягом п’яти діб, якщо вірогідні результати випробування не будуть одержані за коротший час. Відбирають чашки, відповідні одному розведенню, для якого кількість колоній на одній чашці Петрі не перевищує 300 (100 колоній для грибів). Обчислюють середнє арифметичне значення числа колоній і визначають число колонієутворюючих одиниць у грамі або мілілітрі.

b. Метод поверхневого висівання. У чашки Петрі діаметром9 см вносять від 15 мл до 20 мл розплавленого густого живильного середовища для вирощування бактерій (наприклад, середовище МПА) або розплавленого густого живильного середовища для вирощування грибів (наприклад, середовище Сабуро) із температурою близько45°С і дають середовищу застигнути. При використанні чашок Петрі більшого діаметра відповідно збільшують об’єм живильного середовища. Підсушують чашки, наприклад, у ламінарному струмені стерильного повітря або у термостаті. Точно відміряний об’єм зразка(не менше 0,1 мл), підготованого, як описано в розділі«Підготовка зразка», розподіляють по поверхні живильного середовища. Для кожного розведення використовують не менше двох чашок Петрі з кожним живильним середовищем. Інкубацію посівів і визначення числа колонієутворюючих одиниць у г лікарському засобі проводять, як описано вище для методу глибинного висівання.

с. Метод двошарового висівання. У чашки Петрі діаметром9 см вносять від 15 мл до 20 мл розплавленого густого живильного середовища для вирощування бактерій (наприклад, середовища № 1) або розплавленого густого живильного середовища для вирощування грибів(наприклад, середовища № 2) із температурою від 45°С до 50°С і дають середовищу застигнути. При використанні чашок Петрі більшого діаметра відповідно збільшують об’єм живильного середовища. 1 мл зразка, підготованого, як описано в розділі «Підготовка зразка», вносять у пробірку, що містить близько 4 мл розплавленого і охолодженого

80

до температури не більше 45°С густого живильного середовища № 1 або густого живильного середовища № 2. Швидко перемішують вміст пробірки і переносять у чашку Петрі, підготовану, як описано вище, що містить густе живильне середовище № 1 або № 2, відповідно. Швидким погойдуванням чашки Петрі рівномірно розподіляють верхній шар живильного середовища. Для кожного розведення використовують не менше двох чашок Петрі з кожним живильним середовищем. Після застигання середовища чашки перевертають й інкубують при температурі від 30 °С до 35 °С (від 20 °С до 25 °С для грибів) протягом п’яти діб, якщо вірогідні результати випробування не будуть одержані за коротший час. Відбирають чашки, відповідні одному розведенню, для якого кількість колоній на одній чашці Петрі не перевищує300 (100 колоній для грибів). Обчислюють середнє арифметичне значення числа колоній і визначають число колонієутворюючих одиниць у грамі або мілілітрі.

Випробування мікробіологічної чистоти нестерильних лікарських засобів (випробування на окремі види мікроорганізмів).

Методики, викладені в загальній статті, допускають використання селективних живильних середовищ, що не дозволяють виділяти мікроорганізми зі сублетальними ушкодженнями. Якщо для забезпечення якості лікарського засобу потрібно виявляти мікроорганізми зі сублетальними ушкодженнями, треба передбачити процедуру відновлення їхньої життєздатності перед використанням селективних живильних середовищ. Якщо випробовуваний лікарський засіб виявляє антимікробну активність, вона має бути підхожим способом нейтралізована.

Ентеробактерії і деякі інші грамнегативні бактерії

Випробування використовують для виявлення бактерій, що належать до род. Enterobacteriaceae, а також деяких інших грамнегативних бактерій. Випробування проводять методом прямого висівання або методом мембранної фільтрації.

Виявлення бактерій Метод прямого висівання. Готують випробовуваний зразок, як описано

вище. Підготований зразок у кількості, відповідній 1 г або 1 мл лікарського засобу, вносять у 100 мл живильного середовища № 3, гомогенізують і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 18 год до 24 год. Після закінчення періоду інкубації роблять пересівання на чашки Петрі з густими живильними середовищами №4 і №5. Посіви інкубують при температурі від35°С до 37°С від 24 год до 48 год. Наявність на живильних середовищах характерного росту грамнегативних паличок, описаного нижче, вказує на забруднення лікарського засобу бактеріями род. Enterobacteriaceae та деякими іншими грамнегативними бактеріями:

Øгусте живильне середовище №4: круглі малинові з металевим блиском або без нього колонії; рожеві, безбарвні, блискучі опуклі колонії діаметром від 2 мм до 4 мм;

Øгусте живильне середовище № 5: чорні з металевим блиском колонії, ділянки середовища під якими забарвлені в чорний колір; зеленувато-бурі, яснозелені, бурі колонії.

81

Для ідентифікації бактерій род. Enterobacteriaceae підозрілі колонії, кожну окремо, пересівають на середовище № 1, скошене в пробірках, і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 18 год до 24 год. Після закінчення періоду інкубації підтверджують чистоту кожної культури і проводять тест на наявність цитохромоксидази. Культури, що дали негативну реакцію на цитохромоксидазу, пересівають, кожну окремо, у дві пробірки з рідким живильним середовищем №6 і одну пробірку з рідким живильним середовищем №7. Після висівання в одну із двох пробірок із середовищем №6 вносять близько 0,5 мл стерильного вазелінового масла.

Усі посіви інкубують при температурі від35°С до 37°С від 18 год до 24 год. У випадку зміни кольору середовища №6 із червоного на жовтий і, як правило, наявності газоутворення в пробірках з вазеліновим маслом і без нього роблять висновок про ферментацію глюкози. Про наявність нітритів на середовищі №7 судять із появи червоного забарвлення при внесенні у середовище реактиву Грісса. Лікарський засіб витримує випробування, якщо на живильних середовищах не виявлений ріст грамнегативних неспороутворюючих паличок, що дають негативну оксидазну реакцію, ферментують глюкозу з утворенням кислоти (або кислоти і газу) і відновлюють нітрати у нітрити.

Escherichia coli.

Випробування проводять методом прямого висівання або методом мембранної фільтрації.

Метод прямого висівання. 10 мл зразка, підготованого, як описано в розділі «Ентеробактерії і деякі грамнегативні бактерії. Кількісна оцінка. Метод прямого висівання», вносять у 100 мл рідкого живильного середовища №3 і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 18 год до 24 год. Після закінчення інкубації роблять пересівання на густе живильне середовище №4 і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 18 год до 24 год. Ріст характерних малинових колоній з металевим блиском або без нього або рожевих колоній діаметром від 2 мм до 4 мм указує на можливість забруднення лікарського засобу Е. соlі.

Salmonella.

Випробування проводять методом прямого висівання або методом мембранної фільтрації.

Метод прямого висівання. 10 мл зразка, підготованого, як описано вище, вносять у 100 мл рідкого живильного середовища №3 і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 18 год до 24 год. Після закінчення інкубації роблять пересівання 1 мл з середовища №3 у 10 мл рідкого живильного середовища №12 і інкубують при температурі від35°С до 37°С від 16 год до 18 год. Після закінчення періоду інкубації роблять пересівання із середовища №12 на поверхню густого живильного середовища №5 у чашках Петрі і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 24 год до 48 год. Ріст чорних колоній із характерним металевим блиском, під якими ділянка середовища профарбовується у чорний колір, або світлих зеленуватих колоній указує на можливість забруднення лікарського засобу Salmonella.

82

Staphylococcus aureus.

Випробування проводять методом прямого висівання або методом мембранної фільтрації.

Метод прямого висівання. Готують випробовуваний зразок, як описано вище. Підготований зразок у кількості, відповідній 1 г або 1 мл лікарського засобу, вносять у 100 мл живильного середовища №8, гомогенізують і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 18 год до 24 год. Після закінчення періоду інкубації роблять пересівання на чашку з густим живильним середовищем №10 і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 24 год до 48 год. Ріст золота- во-жовтих колоній, оточених жовтими зонами (що свідчить про ферментацію маніту), указує на можливість забруднення лікарського засобу S. aureus.

Pseudomonas aeruginosa.

Випробування проводять методом прямого висівання або методом мембранної фільтрації.

Метод прямого висіванн.я Готують випробовуваний зразок, як описано вище. Підготований зразок у кількості, відповідній 1 г або 1 мл лікарського засобу, вносять у 100 мл живильного середовища №8, гомогенізують і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 18 год до 24 год. Після закінчення періоду інкубації роблять пересівання на чашку з густим живильним середовищем №9 і інкубують при температурі від 35°С до 37°С від 24 год до 48 год. Ріст зеленуватих, як правило, флуоресціюючих колоній, блакитних в ультрафіолетовому світлі (що свідчить про наявність пігменту піоціаніну), указує на можливість забруднення лікарського засобу P. aeruginosa.

Завдання на виконання

1.Провести відбір зразків лікарських засобів для аналізу на стерильність та мікробіологічну чистоту:

Тверді лікарські засоби (порошки та таблетки). Порошки використовують студенти власного приготування з лабораторної роботи №1; таблетки використовують заводського виробництва (кислоти ацетилсаліцилової, вітаміну С, аскорутину, цитрамону, кислоти борної, аспірину, анапріліну, анальгіну тощо), що не покриті оболонкою і не володіють антимікробною активністю(можливе використання таблеток у яких закінчився строк придатності).

Водні розчини, сиропи, ароматні води. Використовують водні розчини за-

водського виробництва (стерильні) (розчини вітамінів, дібазолу, папаверіну, анальгіну тощо), що не володіють антимікробною активністю та розчин глюкози, розчин свинцю, цукровий сироп з лаб. роботи №6 (можливе використання стерильних розчинів у яких закінчився строк придатності).

2.Підготовка зразка:

Тверді лікарські засоби: 1 г порошку розтертих таблеток(розтирання проводять у стерильній фарфоровій ступці за допомогою стерильного пестика за дотримання умов стерильності) стерильно вносять у пробірку з10 мл стерильного фосфатного буферу (рН = 7,0), добре перемішують.

Водні розчини, сиропи, ароматні води. 1 мл досліджуваного зразку (відбір проводять за допомогою стерильного шприца з голкою) за дотримання умов

83