Длительно сохраняются (годы)

ВОДА

Относительно долго сохраняются

Относительно быстро исчезают

1. Enterovirus

2. Salmonella

3. Leptospira

4. Hepatitis A virus

1. E. сoli

2. Sh. dysenteriae

3. V. сholerae

4. Brucella

Отсутствие спорообразования

Факторы, способствующие гибели

воду и, сохраняющихся в ней сравнительно короткое время. Вода неблагоприятная среда для размножения патогенных микроорганизмов, это связано с недостатком пищи, губительным действием солнечного света, с активностью бактериофагов, в изобилии попадающих в воду вместе с бактериями и находящими в ней благоприятные условия и действием других биологических и химических факторов. В результате поступления неочищенных сточных и промышленных вод водоемы загрязняются патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Микрофлора сточных вод состоит из обитателей кишечника человека и животных, включая представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры, а так же, от больных и носителей – патогенную флору. В водоемах, загрязненных испражнениями людей и животных, могут содержаться кишечные палочки, протеи, стафилококки, возбудители кишечных инфекций и др. Загрязнение водоемов микробами, в том числе патогенными, происходит при купании людей, животных, стирке белья. В воду нередко попадают трупы грызунов и других животных, павших от инфекционных заболеваний. Обнаружение в воде патогенных микроорганизмов служит показателем эпидемической опасности. Для оценки санитарно-ги­гиенического состояния воды производится санитарно-бактериологическое исследование. Это исследование основано на определении микробной обсемененности воды и обнаружении в ней, так называемых, санитарно-показательных бактерий.

К санитарно-показательным бактериям воды относятся представители обязательной (облигатной) микрофлоры организма человека и теплокровных животных, для которых средой обитания является кишечник. Они характеризуются тем, что постоянно выделяются в боль­шом количестве из организма с испражнениями, не обитают в других местах, не способны интенсивно размножаться на объектах вне организма, сохраняются в окружающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике.

Санитарно-показательными микробами воды являются кишечные палочки, фекальные стрептококки, обнаружение их в пробах говорит о свежем фекальном загрязнении.

Загрязненность воды относительно санитарно-показательных микроорганизмов определяется по наличию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грамотрицательные палочки, оксидазоотрицательные, не образующие спор, растущие на лактозосодержащих средах типа Эндо, сбраживающие с образованием альдегида, кислоты и газа лактозу (маннит, глюкозу) при температуре 37°С в течение 24-48 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТБК) – это грамотрицательные палочки, неспорообразующие, растущие на лактозосодержащих средах типа Эндо, сбраживающие с образованием альдегида, кислоты и газа лактозу при температуре 44°С в течение 24 часов, не обладающие оксидазной активностью и не растущие на цитратной среде.

Определение ОКБ и ТБК в воде, согласно действующим МУ 2.1.4.1018-01, проводится методом мембранной фильтрации и титрационным методом. Титрационный метод используется, если нет возможности провести исследование методом мембранной, по причине отсутствия материалов и оборудования, необходимых для выполнения или наличия в воде большого количества взвешенных частиц, микрофлоры, препятствующей получению изолированных колоний на фильтрах.

Микробное число – общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1 мл воды.

Титр – минимальный объем, в котором определяется наличие 1-ой особи санитарно-показательных микроорганизмов.

Индекс – количество санитарно-показательных бактерий в 1 мл воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий в воде методом фильтрации (основной метод).

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Объем исследуемой воды зависит от степени бактериального загряз­нения воды:

водопроводная вода – 3 объема по 100,0 мл;

вода водоемов: чистая – в объеме 100,0; 50,0; 10,0; 1,0 мл; загрязненная сточными водами – в объеме 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл; в зоне влияния выпуска сточных вод – 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.

Определение ОКБ и ТБК в воде методом мембранной фильтрации.

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.

Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением следующих требований. Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя. Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум. При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают. Следует начинать с фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы. При фильтровании 1 мл исследуемой воды следует в воронку налить предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем внести анализируемую воду. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

1 день. Исследуемые пробы фильтруют через мембранные фильтры (для получения стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл через один фильтр). Используют фильтровальный аппарат Зейтца. После окончания фильтрации фильтр снимают стериль­ным пинцетом и помещают фильтрующей поверхностью на среду Эндо по 3-4 фильтра, так чтобы они не соприкасались. Чашки с фильтрами инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37°С.

2 день. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 ч.

Учету подлежат все лактозоположительные колонии: красные и темно-красные, с металлическим блеском и без него, выросшие на фильтрах. Подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТБК. Идентифицируют каждую выбранную изолированную колонию по морфологическим свойствам – готовят мазки-препараты и окрашивают по Граму; по биохимическим свойствам – способность ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа, оксидазную активность (для постановки пробы на оксидазу со среды Эндо снимают по 2-3 колонии каждого типа, наносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной диметилпарафенилендиамином, при отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не меняется, при положительном – бума­га окрашивается в синий цвет в течение 1 мин). По 2-3 колонии каждого типа пересевают на среды Гисса с лактозой и инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики. Тест Грегерсена: в капле 3%-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются - реакция отрицательная.

Постановка подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте

Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.

Если на фильтрах все колонии оксидазоположительные, они не учитываются и выдают ответ об отсутствии ОКБ и ТКБ и завершают анализ.

При отрицательной оксидазной реакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ выше указанными методами.

Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37°С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44°С с образованием кислоты и газа.

При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл».

В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.

Результат анализа рассчитывают по следующей формуле:

а х 100

Х =

V

где Х – число колоний в 100 мл исследуемой воды; V – профильтрованный через фильтр объем воды; а – число всех колоний, выросших на фильтрах.

Полученный результат выражают в КОЕ в 100 мл воды.

Общие и термотолерантные колиформные бактерии должны отсутствовать в 100 мл исследуемой воды.

При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах (п.8.2.3.5) в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат «обнаружено ОКБ в 100 мл».

Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершается, в протоколе отмечают «зарост фильтров».

В обоих случаях анализ повторяют.

Определение ОКБ и ТБК в воде титрационным методом.

Титрационный метод может быть использован:

- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

- при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

- в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

В качестве среды накопления используют лактозо-пептонную среду.

1 день. При исследовании водопроводной воды делают посев 3 проб по 100,0 мл, 3 проб по 10,0 мл и 3 проб по 1,0 мл;

воды водоемов: не загрязненных сточными водами – в объеме 10,0; 1,0; 0,1; 0,01 мл; загрязненных сточными водами – в объеме 1,0; 0,1; 0,01; 0,001 мл; в зоне влияния сточных вод – в объеме 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.

Причем для посевов боль­ших объемов (100 мл и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую десятикратные количества необходимых веществ, а малые объемы засевает в обычную глюкозопептонную среду. Посевы инку­бируют в течение 24 часов при 37°С.

2 день. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо для получения изолированных колоний. Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат.

Посевы на среде Эндо помещают в термостат при 37°С на 18-20 часов.

3 день. Просматривают посевы на среде Эндо, учитывают темно-красные или красные колонии, с металлическим блеском или без него. Идентифицируют каждую выбранную изолированную колонию по морфологическим свойствам – готовят мазки-препараты и окрашивают по Граму; по биохимическим свойствам – способность ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа, оксидазную активность. По 2-3 колонии каждого типа пересевают на среды Гисса с лактозой и инкубируют при 44°С в течение 24 часов.

Розовые, бесцветные, пленчатые колонии и колонии грибов на среде Эндо не учитываются.

При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 мл».

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблицам .

Результат сообщают без доверительного интервала.

При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены в 100 мл».

Таблица . Расчет наиболее вероятного числа бактерий (НВЧ) в 100 мл питьевой воды централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения.

Число положительных результатов из 3-х объемов			НВЧ бактерий в 100 мл	Довери-тельный интервал (95%)		Число положительных результатов из 3-х объемов			НВЧ бактерий в 100 мл	Довери-тельный интервал (95%)
по 100 мл	по 10 мл	по 1 мл		ниж-ний	верх-ний	по 100 мл	по 10 мл	по 1 мл		ниж-ний	верх-ний
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2	0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0	1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0	0,3 * * 0,3 * * * 0,6 * * * * * * * 0,4 0,7 * * 0,7 1,1 * * 1,1 * * * * * * * 0,9	0 0,1 0,2 0,1 1,1 1,2 0.3 0,1 0,2 0,3 0,3 0,2 0,3 0,3 0,4 0,1 0,2 0,2 0,3 0,2 0,2 0,3 0,4 0,2 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,6 0,2	1,4 2,8 4,2 1,4 2,8 4,3 5,7 2,8 4,3 5,8 7,3 4,4 5,9 7,4 8,9 1,7 3,4 5,0 6,9 3,4 5,2 7,1 8,9 5,3 7,1 9,0 11,1 7,3 9,3 11,3 13,4 4,3	2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3	0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3	1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3	1,4 * * 1,5 2 * * 2 3 * * 3 * * * 2 4 6 * 4 8 12 * 9 15 21 29 24 46 110 ≥ 240	0,3 0,4 0,6 0,3 0,4 0,6 0,7 0,5 0,6 0,7 0,9 0,6 0,8 0,9 1,1 0,5 0,8 1,4 2,0 0,9 1,6 2,5 3,4 2,0 3,2 4,6 6,2 5,1 9,3 23,5 -	6,7 9,3 12,1 6,9 9,6 12,5 15,7 9,9 12,9 16,3 19,8 13,3 16,8 20,6 24,6 10,8 18,0 29,7 44,6 20,0 35,0 53,8 74,2 43,6 69,8 100,3 136,4 112,1 216,0 516,0 -

Примечание: * - вероятность ниже допустимого уровня, количественный учет невозможен.

Таблица . Расчет наиболее вероятного числа бактерий (НВЧ) в 100 мл воды водоемов.

Число положительных результатов из 3-х объемов			НВЧ бактерий в 100 мл		Число положительных результатов из 3-х объемов				НВЧ бактерий в 100 мл
по 1 мл	по 0,1 мл	по 0,01 мл			по 1 мл	по 0,1 мл	по 0,01 мл
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1	0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3	0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3		менее 30 30 60* 90* 30 61* 92* 120* 62* 93* 120* 160 94* 130* 160* 190* 36 72 110* 150* 73 110 150* 190* 110 150* 200* 240* 160* 200* 240* 290*		2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3	0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3	0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3	91 140 200* 260* 150 200 270* 340* 210 280 350* 420* 290 360* 440* 530* 230 390 640 950* 430 750 1200 1600* 930 1500 2100 2900 2400 4600 11000 более 11000

Примечание: * - вероятность ниже допустимого уровня.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий в воде.

Сульфитредуцирующие клостридии – спорообразующие палочки, анаэробы, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре, с образованием черных колоний, при температуре 44°С в течение 16-18 часов.

Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний.