Дигибридное скрещивание

Сущность дигибридного скрещивания. Организмы различаются по многим генам и, как следствие, по многим признакам. Чтобы одновременно проанализировать наследование нескольких признаков, необходимо изучить наследование каждой пары признаков в отдельности, не обращая внимания на другие пары, а затем сопоставить и объединить все наблюдения. Именно так и поступил Мендель.

Скрещивание, при котором родительские формы отличаются по двум парам альтернативных признаков (по двум парам аллелей), называется дигибридным. Гибриды, гетерозиготные по двум генам, называют дигетерозиготными, а в случае отличия их по трем и многим генам —три- и полигетерозиготными соответственно.

Результаты дигибридного и полигибридного скрещивания зависят от того, располагаются гены, определяющие рассмотренные признаки, в одной хромосоме или в разных.

Независимое наследование (третий закон Менделя). Для дигибридного скрещивания Мендель использовал гомозиготные растения гороха, различающиеся одновременно по двум парам признаков. Одно из скрещиваемых растений имело желтые гладкие семена, другое — зеленые морщинистые (рис. 3.3).

Рис 3.3. Дигибридное скрещивание растений гороха, различающихся по форме и окраске семян.

Все гибриды первого поколения этого скрещивания имели желтые гладкие семена. Следовательно, доминирующими оказались желтая окраска семян над зеленой и гладкая форма над морщинистой. Обозначим аллели желтой окраски А, зеленой — а, гладкой формы— В, морщинистой— b. Гены, определяющие развитие разных пар признаков, называются неаллельпыми и обозначаются разными буквами латинского алфавита. Родительские растения в этом случае имеют генотипы АА ВВ и aabb, а генотип гибридов F1 —АаВb ,т. е. является дигетерозиготным.

Во втором поколении после самоопыления гибридов F1 в соответствии с законом расщепления вновь появились морщинистые и зеленые семена. При этом наблюдались следующие сочетания признаков: 315 желтых гладких, 101 желтое морщинистое, 108 зеленых гладких и 32 зеленых морщинистых семян. Это соотношение очень близко к соотношению 9:3:3:1.

Чтобы выяснить, как ведет себя каждая пара аллелей в потомстве дигетерозиготы, целесообразно провести раздельный учет каждой пары признаков — по форме и окраске семян. Из 556 семян Менделем получено 423 гладких и 133 морщинистых, а также 416 желтых и 140 зеленых. Таким образом, и в этом случае соотношение доминантных и рецессивных форм по каждой паре признаков свидетельствует о моногибридном расщеплении по фенотипу 3:1. Отсюда следует, что дигибридное расщепление представляет собой два независимо идущих моногибридных расщепления, которые как бы накладываются друг на друга.

Проведенные наблюдения свидетельствуют о том, что отдельные пары признаков ведут себя в наследовании независимо. В этом сущность третьего закона Менделя — закона независимого наследования признаков, или независимого комбинирования генов.

Он формулируется так: каждая пара аллельных генов (и альтернативных признаков, контролируемых ими) наследуется независимо друг от друга.

Закон независимого комбинирования генов составляет основу комбинативной изменчивости (см. § 3.4), наблюдаемой при скрещивании у всех живых организмов. Отметим также, что в отличие от первого закона Менделя, который справедлив всегда, второй закон действителен только для генов, локализованных в разных парах гомологичных хромосом. Это обусловлено тем, что негомологичные хромосомы комбинируются в клетке независимо друг от друга, что было доказано не только при изучении характера наследования признаков, но и прямым цитологическим методом. Поведение хромосом при дигибридном скрещивании показано на рис. 3.4.

Цитологические основы дигибридного скрещивания. Как известно, в профазе I мейоза гомологичные хромосомы конъюги-руют, а в анафазе одна из гомологичных хромосом отходит к одному полюсу клетки, а другая — к другому. При расхождении к разным полюсам негомологичные хромосомы комбинируются свободно и независимо друг от друга. При оплодотворении в зиготе восстанавливается диплоидный набор хромосом и гомологичные хромосомы, оказавшиеся в процессе мейоза в разных половых клетках родителей, соединяются вновь.

Предположим, что каждая хромосома содержит только один ген. Палочковидные хромосомы несут аллель A или а , сферические —В или b, т. е. эти две пары аллелей находятся в негомологичных хромосомах

Гомозиготные родители (ААВВ и aabb) формируют только один тип гамет с доминантными (АВ) или с рецессивными (ab) аллелями. При слиянии таких гамет образуется единообразное первое поколение гибридов — гибрид дигетерозиготен (АаВb), но так как у него присутствуют гены А и B, то по фенотипу он сходен с одним из родителей.

В тех случаях, когда необходимо указать, что те или иные гены находятся в гомологичных хромосомах, в генетических формулах зигот хромосомы принято изображать в виде двух черточек или одной с указанием обоих аллелей гена. Формула дигетерозиготы может быть записана так. Поскольку гаметы содержат только по одной из гомологичных хромосом и соответственно по одному аллелю каждого гена, то их формулы могут быть записаны так: и т. д.

В дальнейшем у гибридных организмов ло причине случайности расхождения отцовских и материнских хромосом каждой пары в процессе мейоза ген А может попасть в одну гамету с геном В или с геном Ь. Точно так же ген а может оказаться в одной гамете с геном В или с геном b. Поэтому гибриды образуют четыре типа гамет: Образование всех четырех типов гамет равновероятно, т. е. все они образуются в равных количествах. Свободное сочетание таких гамет в процессах оплодотворения заканчивается образованием 16 типов зигот, а значит, и потомков.

Они распадаются на четыре фенотипических класса: доминантные по обоим признакам — 9 частей, доминантные по первому и рецессивные по второму признаку — 3 части, рецессивные по первому и доминантные по второму — 3 части, рецессивные по обоим признакам — 1 часть. Генотипических классов 9: 1AABB, 2ААВb, 1AAbb, 1Aabb, 4AaBb, 2AaBB, 1aaBB, 2aaBb, 1aabb.

Полигибридное скрещивание. Рассуждая аналогично, можно представить расщепление при три- и полигибридном скрещивании, т. е. когда родители различаются по аллелям трех и более генов, а в F1 образуются три- и по дигетерозиготы. Соотношение генотипических и фенотипических классов в F2 три- и полигибридных скрещиваний, а также число типов гамет (и число фенотипов) у гибридов F1 определяются простыми формулами: примоногибридном скрещивании число типов гамет равно 2, при дигибридном 4(22), а при полигибридном — 2n; число генотипов равно соответственно 3,9(32) и 3n.

Опираясь на независимость наследования разных пар аллелей, можно также любые сложные расщепления представить как произведение от соответствующего числа независимых моногиб-ридиых скрещивании. Общая формула определения фенотипических классов при полигибридном скрещивании имеет вид (3:1)n, где п равно числу пар признаков, по которым идет расщепление. Для моногибрида эта формула соответственно имеет вид (3:1); дигибрида — 9:3:3:1 или(3:1)2;тригибрида — (3:1)3. Расщепление по генотипу имеет вид (1:2; 1)n, где п — число расщепляющихся пар аллелей.

Известно, что каждый организм гетерозиготен по многим генам. Если предположить, что человек, у которого отдельные пары хромосом содержат не одну, а сотни пар аллелей, гетерозиготен хотя бы по 20 генам, то число типов гамет у такой полигетерозиго-ты составит 220 = 1 048 576. Эта цифра дает определенное представление о потенциальных возможностях комбинативной изменчивости. Поэтому каждый человек обладает неповторимой индивидуальностью. На Земле нет двух людей, совершенно одинаковых по наследственности, за исключением однояйцевых близнецов.

Таким образом, третий закон Менделя (закон независимого наследования признаков) еще раз демонстрирует дискретный характер генетического материала. Это проявляется в независимом комбинировании аллелей разных генов и в их независимом дей-ствии — фенотипическом выражении.

Дискретность гена определяется тем, что он контролирует присутствие или отсутствие отдельной биохимической реакции, от которой зависит развитие или подавление определенного признака организма. Очевидно, если несколько генов определяют какое-либо одно свойство или один признак (форма гребня у кур, окраска глаз у дрозофилы, длина колоса у пшеницы и т. д.), они должны взаимодействовать между собой. Отсюда следует, что понятие «наследование признаков» употребляется, скорее всего, как образное выражение, поскольку в действительности наследуются не сами признаки, а гены. Признаки формируются в ходе индивидуального развития организма, обусловливаются генотипом и влиянием внешней среды.

4. Изучение изменчивости признаков методами вариационной статистики.

-понятия о генеральной и выборочных совокупностях,

-вариационный ряд и его графическое изоображение,

-вычисление статистических показателей большой и малой выборок,

-определение уровня вероятности статистических показателей и достоверности различии между группами животных,

-доверительнее границы и правило трёх сигм,

-критерий хи-квадрат,

-коррелятивная связь между признаками.

5. Хромосомная теория наследственности

-сцепленное наследование признаков,

-кроссинговер,

-хромосомная теория наследственности;

Хромосомная теория наследственности

Основоположник теории Томас Гент Морган, американский генетик, нобелевский лауреат, выдвинул гипотезу об ограничении законов Менделя.

В экспериментах он использовал плодовую мушку-дрозо-филу, обладающую важными для генетических экспериментов качествами: неприхотливостью, плодовитостью, небольшим количеством хромосом (четыре пары), множеством четко выраженных альтернативных признаков.

Морган и его ученики установили следующее:

1. Гены, расположенные в одной хромосоме, наследуются совместно или сцепленно.

2. Группы генов, расположенных в одной хромосоме, образуют группы сцепления. Число групп сцепления равно гаплоидному набору хромосом у гомогаметных особей и п+1 у гетерогаметных особей.

3. Между гомологичными хромосомами может происходить обмен участками (кроссинговер); в результате кроссин-говера возникают гаметы, хромосомы которых содержат новые комбинации генов.

4.Частота кроссинговера между гомологичными хромосомами зависит от расстояния между генами, локализованными в одной хромосоме. Чем это расстояние больше, тем выше частота кроссинговера. За единицу расстояния между генами принимают 1 морганиду (1% кроссинговера) или процент появления кроссоверных особей. При значении этой величины в 10 морганид можно утверждать, что частота перекреста хромосом в точках расположения данных генов равна 10% и что в 10% потомства будут выявлены новые генетические комбинации.

5. Для выяснения характера расположения генов в хромосомах и определения частоты кроссинговера между ними строят генетические карты. Карта отражает порядок расположения генов в хромосоме и расстояние между генами одной хромосомы. Эти выводы Моргана и его сотрудников получили название хромосомной теории наследственности. Важнейшими следствиями этой теории являются современные представления о гене как о функциональной единице наследственности, его делимости и способности к взаимодействию с другими генами.

Пример сцепленного наследования:

Vg — нормальные крылья дрозофилы;

vg — зачаточные крылья;

ВВ— серая окраска тела;

bb — темная окраска тела.

Запись в хромосомном выражении:

В данном случае правило единообразия гибридов первого поколения соблюдается. В соответствии со вторым и третьим законами Менделя следовало ожидать при последующем анализирующем скрещивании по 25% каждого из возможных фенотипов (серых, длиннокрылых мух, серых короткокрылых, черных длиннокрылых и черных коротко-крылых). Однако опыты Моргана не дали таких результатов. При скрещивании рецессивной по обоим признакам самки VgVgbb с гибридным самцом из F1 образовалось 50% серых мух с короткими крыльями и 50% мух с черным телом и длинными крыльями:

Если же скрещивают дигибридную самку с гомозиготным рецессивным самцом, то в образуется потомство: 41,5% — серых с короткими крыльями, 41,5% — черных с длинными крыльями, 8,5% — серых с длинными крыльями, 8,5% — черных с короткими крыльями.

Данные результаты свидетельствуют о наличии сцепления генов и кроссинговере между ними. Так как в потомстве от второго скрещивания было получено 17% рекомбинант-ных особей, то расстояние между генами Vg и В равно 17%, или 17 морганидам.

Наследование, сцепленное с полом

Хромосомные наборы разных полов отличаются по строению половых хромосом. У-хромосома мужчин не содержит многих аллелей, имеющихся в Х-хромосоме. Признаки, определяемые генами половых хромосом, называют сцепленными с полом. Характер наследования зависит от распределения хромосом в мейозе. У гетерогаметных полов признаки, сцепленные с Х-хромосомой и не имеющие аллеля в У-хро-мосоме, проявляются даже в том случае, когда ген, определяющий развитие этих признаков, — рецессивен. У человека У-хромосома передается от отца к сыновьям, а Х-хромосо-ма — к дочерям. Вторую хромосому дети получают от матери. Это всегда Х-хромосома. Если мать несет патологический рецессивный ген в одной из Х-хромосом (например, ген дальтонизма или гемофилии), но при этом сама не больна, то она является носительницей. В случае передачи этого гена сыновьям они могут родиться с данным заболеванием, ибо в У-хромосоме нет аллеля, подавляющего патологический ген. Пол организма определяется в момент оплодотворения и зависит от хромосомного набора образовавшейся зиготы. У птиц гетерогаметными являются самки, а гомогаметными — самцы. У пчел половых хромосом вообще нет. Самцы гаплоидны. Самки пчел диплоидны.

Пример наследования, сцепленного с полом

Основные положения хромосомной теории наследственности:

• каждый ген имеет в хромосоме определенный локус (место);

• гены в хромосоме расположены в определенной последовательности;

• гены одной хромосомы сцеплены, поэтому наследуются преимущественно вместе;

• частота кроссинговера между генами равна расстоянию между ними;

• набор хромосом в клетках данного типа (кариотип) является характерной особенностью вида.

6. Генетика пола

-наследование пола; теории определения пола;

-нарушения в развитии признаков пола, обусловленные патологиями набора половых хромосом;

-фримартинизм;

-гермофродитизм и гинандроморфизм;

-проблемы регулирования пола у животных и пути ее решения ;

-особенности наследования сцепленных с полом признаков;

-ограниченные полом признаки и их наследование.

Генетика пола

Наследование пола.

Теории определения пола Различают три пути, опеределяющих формирование особей того или иного пола.

1.Прогамное определение пола. Характеризируется тем что формирование особей того или иного полаопределяется еще в организме самки и зависит от размера яйцеклеток. При этом из мелких яйцеклеток (и цитоплазма ала) после оплодотворения развиваются самцы, а из крупных самки. Наблюдается у коловороток, тлей и морских червей.

2.Эпигамное определение пола наступает после оплодотворения, на последующих стадиях развития особи. Обнаружена у морского червя БОНЕЛЛИА, развитие личинки этого червя может происходить двояко:

- если личинка свободно плавает в морской воде и позднее оседает на дно, то она становится самкой;

- если же личинка прикрепляется к хоботу взрослой самки, то под влиянием гормонов, выделяемых этой самки, из нее формируется самец.

3.Сингамное определение пола характеризуется тем, что пол будущей особи, определяется при оплодотворении гамет, в результате соответствующего сочетания половых хромосом, т.е. при образовании зиготы.

Характерна для млекопитающих, птиц, рыб, двукрылых насекомых, двудомных растений.

Сингамное определение пола объясняется двумя теориями:

А) хромосомной теорией определения пола

Б) балансовой теорией определения пола

Наблюдения, проведенные на животных разных видов, показали, что среди новорожденных 50% составляют самцы, и 50 % самки.

Р ХХ * ХУ

ххху гаметы

хххххуху

♀ самки ♂самцы

50% 50%

Наследование пола. Половые хромосомы и аутосомы. Генотипический пол особи обусловлен различиями в хромосомном аппарате мужских и женских особей.

Начиная 1901г появились предположения и цитологические подтверждения. (гомогаметный пол, гетерогаметный пол)

Рыбы: - самцы - млекопитающих, большая часть насекомых (и дрозофила), малюски, нематод.

- самки – птиц, пресмыкающихся, бабочки некоторых видов (тутовый шелкопряд).

Х и У хромосомы почти не отличаются от аутосомы: 1) в них накоплен гены признаков; 2) линейность расположения генов; 3) происходит кроссинговер(когда ХХ), поэтому составлена карта хромосом; 4) морфологическая и химическая структура.

Аутосомы и половые хромосомы

Х – ХХ ♀	Z – ZZ ♂
Y – XY ♂	W – ZW ♀

В Y– W тех генов, которые находятся в Х – Z нет, большая часть их является генетический пустой то есть, состоит в основном генетический инертного материала.

Половой хроматин или тельце Барра (1949) = – 1.

ГЕНЕТИКА ПОЛА

Яйцеклетки	Спермии Зиготы	фенотип
Спермии Яйцеклетки		молекопитающих	птиц
Х х хх Х у ху		Нормальная схема Нормальный самец	Нормальный самец Нормальная схема
Ху х ххх		Самка трисомией-Х
0 х х 0		Самка с синдромом Шермевского - Тернера
Х 0 х 0
Х хухху		Самец с синдромом клайнфельтера
Х хухху
0 уу 0		нежизнеспособен

Интерсекс- это однополая особь, у который придаточные половые железы, половые органы или вторичные половые признаки изменены в направлении противоположного пола.

Такихинтерсексов иногда называют псевдогермофрадитами.

Фримартины- это гормональные интерсексы генетический женского пола из разнополых двоен.

Среди телок из разнополых двоен 92% фримартины.

Истинный гермофродит- это особь, который обладает как женскими так и мужскими половыми железами и продуцирует как яйцеклетки, так испермии.

Пригина:химеризм соматических клеток организма по набору половых храмосом- ХХ и ХУ.

Гинануроморф – особь, часть тела которого является генетический мужским, а другая часть – женским.

Аномалии, затрагивающие морфологические и физиологические системы.

♀ аномальные гаметы
ХХ		О
ХХХ Синдром метасамец	ХХУ Синдром Клайнфельтера	ХО Синдром Тернера	УО Не жизнеспособен

Балансовая теория определения пола. В 1919 гБриджес предложил БАЛАНСОВУЮ теорию определения пола, согласно которой у дрозофилы, у кузнечика и некоторых других насекомых пол особи определяется соотношением аутосом и Х хромосомой. При этом предполагается, что гены обуславливающие развитие мужской особи локолизированы в аутосомах, а гены – развития женской особи в Х хромосомах.

Дрозофила – по табл.плакату.

ХХУ – самка нормальная ХХУ – самец (мужск.)

ХО – самец бесплодный ХО – самка (женск.)

У хромосома не определяет пол, а плодовитость.

Набор

Аутосома Х хромосома Аутосома Х хромосома (Х: Аутосома)

6:2 2:2 (1,0) или 1:1 самка - ♀

6:1 2:1 (0,5) 2:1 самец - ♂

9:2 3:2 (0,67) интерсекс

Интерсекс (от лат. inter — между и sexus — пол)– это однополая особь, у которой в той или иной степени развиты одновременно признаки как одного, так и другого пола, то есть у которой придаточные половые железы, половые органы или вторичные половые признаки изменены в направлении противоположного пола.

Истинный гермофродит – это особь которая обладает как женскими, так и мужскими половыми железами и продуцирует как яйцеклетки, так и спермы.

Гинандоморф – часть или некоторые части его тела является генетический мужскими, а часть генетический женскими.

Фримартины – это гормональные интерсексы генетический женского пола из разнополых.

Проблемы регулирования пола у животных и пути ее решения

1. Метод разделения Х и У сперматозоидов по удельному весу (удельный вес Х больше У) – до конца не разработан, хотя имеются некоторые положительные результаты.

1.2) Метод разделения спермиев с помощью электрофареза, Шредер – на кроликах:

К А

10°С - ♂ 83% ♂ 17%

=

25°С - ♀ 20% ♀ 75%

/Это возможность подтверждена в дальнейшем М.С.Левиным и Г.С.Гордоном.

3. Метод иммунизации (Шредер). Путем иммунизации хряков и свиней против спермиев определенного типа, путем инъекции им спермы с анода или с катода. Сдвиг до 75%, но полного сдвига все же не получено.

2. Метод разделения спермы – находящийся в состоянии температурно – кислотного анабиоза (разработан Владимирской и Харченко): сперму под кислым аминокислотой гистидином до рН = 6,0, при t= 18 – 21° и наливал и в пробирки закупорили;

♂ 31,78%

♂ 57,66% анабиоз, контроль 50,88% = 50,77%.

3. Б.Л.Асатуров на тутовом шелкопряде добился явлении гиногенеза (только самки) и андрогенеза (только самцы).

Тепловым шоком при методе задерживалось редукционные деления и образовывались диплоидные яйца с Zи W – хромосомами, развивавшееся ПАРТЕГЕНЕТИЧЕСКОЙ, то есть без оплодотворения. Таким образом получились только самки (ZW). Для получения только самцов (ZZ) Асатуров подогреванием или действием радиации разрушал поры яйцематки. При последующем оплодотворении в яйцематку проникал не один, а два сперматазоида с Z хромосомой, и получил зиготу ZZ.

5)При увеличении количества спермы в половы путях ♀ число ♂ в потомстве кур и свиней возрастало.

6)При добавке в рацион кроликов белков животного происхождение и подкормке кур метионином увеличивается удельный вес ♀

При избытке в рационе амикокислот метионина повышается удельный вес ♀

Аспаргина →♂

(Г.В. Гаршутин. В.И.Михайлов)

7)При обработке петухов и хряков малыми дозами гормона метилстестостерона увеличился удельный вес ♂

8)При спаривании одновозрастных хряков и свиноматок было получено следующие количество потомков женского пола:

Возраст родителей: Удельн.вес потомства♀

До 1 года 45,7%

2 года 50,8%

3 года 50,4%

4 года 49,2%

5 года 37,2%

6 года 41,1%

Соотношение полов в популяциях обусловлен не только генетический.

Использование разделенного по полу семени в практике животноводства

Регуляция пола у сельскохозяйственных животных представляет значительный практический интерес, поскольку способствует ускорению генетического прогресса в селекционно-племенной работе. Ранее изучалась возможность разделения сперматозоидов, содержащих Х- или Y-хромосому следующими способами: осаждение, центрифугирование в градиенте, электрофорез, обработка специфическими антителами и т.д. (1-3). Однако на практике не было получено убедительных доказательств эффективности этих приемов.

В последние годы во многих странах мира для разделения спермы по полу используют метод проточной цитометрии, основанный на различном содержании ДНК в сперматозоидах (4-6). В 1979 году было установлено, что Х-хромосома млекопитающих содержит большее количество ДНК по сравнению с Y-хромосомой (7). Так, у быков это различие составляет 3,8, у хряков - 3,6, у баранов - 4,2, у жеребцов - 3,7 % (4, 8). При разделении сперматозоидов было предложено использовать специальный краситель для ДНК и аналитическую проточно-цитометрическую систему, которую дополнили приспособлением для направленной ориентации клеток в потоке, что способствует более четкому выявлению различий в их светоизлучении (9).

На основании результатов исследований, проведенных американскими учеными, была усовершенствована обычная аналитическая проточно-цитометрическая система и разработана Белтсвилская технология разделения спермы, которая состоит из нескольких операций (10, 11). В состав разбавленной спермы добавляют флуоресцентный витальный краситель Hoechst 33342 и инкубируют ее при 35 °С в течение 1 ч для лучшего проникновения красителя через мембранные структуры половых клеток. Затем сперма под давлением поступает в высокоскоростной проточный цитометр, где создаются условия ориентации головки сперматозоидов при пересечении лазерного луча. Лазерное излучение инициирует флуоресценцию красителя, которая улавливается мощным световым детектором и анализируется компьютером. После идентификации сперматозоидов, содержащих Х или Y-хромосому, специальный вибратор образует в растворе микрокапельки, куда попадают половые клетки. Каждая микрокапелька содержит один сперматозоид и заряжается положительно или отрицательно в зависимости от величины светоизлучения, обусловленной содержанием в половой клетке Х- или Y-хромосомы. Капельки с поврежденными или не идентифицированными сперматозоидами не заряжаются. В современных установках образуется 70-80 тыс. микрокапелек в секунду (12). После этого сперматозоиды проходят через электростатическое поле и разделяются на положительно, отрицательно или нейтрально заряженные частицы, которые поступают в разные емкости. Затем сперматозоиды центрифугируют для увеличения их концентрации и разбавляют специальной средой (13-15).

В первое время после разработки описанной технологии использовали стандартную скоростную систему с рабочим давлением в пределах 0,84 кг/см2. При этом скорость разделения клеток составляла 350 тыс сперматозоидов в час (10). Позднее, когда технология была усовершенствована, в том числе за счет повышения давления в системе до 4,22 кг/см2, стало возможным сортировать до 11 млн сперматозоидов в час и получать образцы, содержащие 90 % клеток с Х- или Y-хромосомой (8).

Были проведены углубленные исследования в области улучшения ориентации головки сперматозоидов относительно лазерного луча и оптического детектора (5, 14, 16). Вследствие плоской формы головки лишь 30 % клеток имеют правильную пространственную ориентацию при прохождении через лазерный луч, причем только половина из них содержит Х- или Y-половую хромосому. Из общего объема эякулята удается получить не более 15 % сперматозоидов с определенной половой хромосомой, что обусловливает высокую стоимость разделенного по полу семени. В настоящее время разделенная сперма быков может быть экономически выгодной производителю только если в дозе содержится пониженное число сперматозоидов (~ 2 млн подвижных клеток по сравнению с 10-15 млн сперматозоидов, применяемых при обычном осеменении крупного рогатого скота криоконсервированной спермой).

Во время разделения с помощью высокоскоростной проточной цитометрии сперматозоиды подвергаются действию таких неблагоприятных факторов как окрашивание, высокая степень разбавления семени, воздействие лазерного излучения и давления, электромагнитное влияние, центрифугирование (17-19), поэтому важна разработка условий для сохранения биологической полноценности половых клеток. В частности, для предохранения их от агглютинации в состав буферного раствора вводят 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, а после разделения сперматозоиды попадают в TEST-желточный буфер (20). Показано, что лучшая подвижность сперматозоидов после оттаивания сохраняется в случае центрифугирования половых клеток сразу после разделительного процесса и добавления глицерина в состав охлажденного до 4 °С семени незадолго до замораживания (21). Для проверки чистоты разделения образцов спермы на Х- и Y- фракции применяют полимеразную цепную реакцию (22), а также метод флуоресцентной гибридизации (23).

В 1988 году установлено, что разделенные с помощью проточной цитометрии сперматозоиды способны к образованию пронуклеуса при введении в ооциты хомячков (24). В том же году английскими исследователями были проведены первые опыты по использованию разделенной спермы для искусственного осеменения телок и крольчих (25). Две группы телок осеменяли с помощью цервикального введения фракции сперматозоидов с Х- или Y-хромосомой. В дозе содержалось 5 млн клеток. Оплодотворяемость животных оказалась очень низкой, и телки в основном абортировали между 4-м и 5-м мес беременности. Изучение половых органов у абортированных плодов показало, что в случае осеменения Х-фракцией 8 из 11 плодов были самками, при использовании Y-фракции 12 из 20 плодов - самцами. Низкие результаты оплодотворяемости были получены и у крольчих, однако в этом случае удалось получить живых крольчат, которые нормально развивались и в дальнейшем принесли здоровое потомство.

В опытах американских ученых по осеменению крольчих сперму самкам вводили внутриматочно. В группе, где использовали фракцию сперматозоидов с Х-хромосомой, получили 94 % самок, с Y-хромосомой - 81 % самцов (10). Внутритрубное введение свиньям разделенного по полу семени хряков позволило получить в потомстве 68 % самцов при оплодотворении спермой с Y-хромосомой и 74 % самок при использовании Х-фракции (20).

Позднее были проведены успешные эксперименты по оплодотворению яйцеклеток крупного рогатого скота разделенными сперматозоидами invitro (26). С помощью проточной цитометрии получали фракции спермы, содержащие до 79 % половых клеток с Х-хромосомой и до 70 % - с Y-хромосомой. Телкам пересаживали эмбрионы предполагаемого пола, в результате чего в первой группе родилось 3 телочки, во второй - 3 бычка. В последующих опытах удалось получить до 90 % телят мужского пола (27).

Также был проведен ряд экспериментов по изучению эффективности пересадки коровам эмбрионов, полученных invitro с помощью разделенного семени (28). Приживляемость эмбрионов у коров со спонтанным эструсом составила 16,3, у коров с синхронизированным эструсом - 20,0, у телок - 34,2 %. Из 40 родившихся телят 37 были телочками.

В более поздних исследованиях изучали эффективность пересадок коровам заморожено-оттаянных эмбрионов, полученных invitro с использованием фракции Х-сперматозоидов (29). Приживляемость таких эмбрионов в опытной группе составила 40,9 %, в контрольной, где использовались обычные эмбрионы, - 41,9 %. Всего родилось 458 телят, из которых 96,8 % были самками.

В связи с тем, что скорость разделения сперматозоидов при проточной цитометрии не позволяет получать достаточно семени для обычного искусственного оплодотворения крупного рогатого скота, была изучена возможность введения половых клеток непосредственно в рога матки (30, 31). Не разделенную сперму, содержащую 100-500 тыс. сперматозоидов, вводили в рог матки телок с помощью инструментов для эмбриопересадки. В некоторых группах результаты оплодотворяемости были довольно высокими. Затем для осеменения телок использовали разделенную фракцию не замороженной спермы, содержащей в дозе 100-200 тыс. сперматозоидов. Из 17 полученных телят 14 соответствовали предполагаемому полу (31). В другом опыте 35 телкам в рога матки вводили по 300 тыс. не замороженных разделенных сперматозоидов, содержащих преимущественно Х-хромосому, а контрольных животных осеменяли такой же дозой не разделенной спермы. Оплодотворяемость в опытной группе составила 42 %, в контроле - 54 %. В опытной группе было получено 80 % телочек (32). В экспериментах по осеменению пониженной дозой заморожено-оттаянных разделенных по полу сперматозоидов (1 млн клеток) оплодотворяемость составила 52 %. Эти показатели сопоставимы с результатами обычного искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой, содержащей в дозе 15-20 млн половых клеток (33). При внутриматочном осеменении телок разделенной по полу криоконсервированной спермой (1; 1,5 или 3 млн сперматозоидов в дозе) также удалось получить высокие показатели оплодотворяемости (43-54 %) (34).

В полевых испытаниях швейцарских ученых телкам и коровам опытных групп внутриматочно вводили по 2 млн подвижных заморожено-оттаянных сперматозоидов с Х-хромосомой. В контрольных группах животных осеменяли аналогичной дозой не разделенных половых клеток. В опытной и контрольной группах отелилось соответственно 29,6 и 55,6 % телок; 21,9 и 23,4 % коров. При этом в опытных группах родилось 85,3 % самок, в контрольных - 58,6 % (35).

Эстонские исследователи выясняли эффективность осеменения телок разделенной спермой при введении 2,2 млн заморожено-оттаянных сперматозоидов в маточно-трубное сочленение, рога или тело матки (36). Оплодотворяемость телок во всех вариантах оказалась практически одинаковой и составила соответственно 37,7; 42,2 и 39,6 %.

В Финляндии проводились испытания по осеменению коров голштинской породы криоконсервированной разделенной спермой (37). Во время спонтанной охоты 157 опытным коровам вводили внутриматочно 2 млн разделенных сперматозоидов, 149 контрольным коровам - 15 млн не разделенных сперматозоидов. В опытной группе отелилось 20 % коров и родилось 82 % телочек. В контроле эти показатели составили соответственно 45 и 49 %. Полученные результаты свидетельствуют о значительном снижении оплодотворяемости при использовании для осеменения пониженного числа сперматозоидов в дозе разделенной спермы.

В экспериментах итальянских ученых при введении телкам внутриматочнокриоконсервированной разделенной спермы, полученной от четырех быков (1 или 2 млн сперматозоидов), оплодотворяемость составила 51 %, в потомстве было 87 % самок. Кроме того, были выявлены достоверные различия в оплодотворяющей способности семени у разных быков. По мнению авторов, необходимо проводить тщательный отбор быков перед их использованием для получения разделенной по полу спермы (38).

В полевых испытаниях, проведенных в США на 211 фермах, оплодотворяемость телок голштинской породы Х-содержащей фракцией сперматозоидов достигала 47 %, телок джерсейской породы - 53 %. В потомстве получено 89 % самок (39). Кроме того, был установлен факт более высокой мертворожденности телят мужского пола при осеменении телок сперматозоидами с Х-хромосомой.

В специальных исследованиях изучали влияние процесса разделения спермы с помощью скоростной проточной цитометрии на состояние здоровья и развитие телят, а также на генетические изменения у потомства (40). Используя данные по 1169 и 793 телятам, полученным соответственно при оплодотворении коров разделенной и обычной спермой, анализировали продолжительность беременности, легкость отела, частоту абортов и мертворождений, живую массу телят при рождении и отъеме, смертность телят в неонатальный и более поздний период, а также различные анатомические аномалии. Достоверных различий в изучаемых показателях между двумя группами животных установлено не было. При использовании не разделенной спермы получили 49,2 % бычков, Х-содержащей фракции сперматозоидов - 87,8 % самок, Y-содержащей фракции - 92,1 % самцов. Разделение спермы не оказывало влияния на раннюю эмбриональную смертность у телок (34).

Применение высокоскоростной проточной цитометрии для разделения сперматозоидов быков не оказывает отрицательного влияния на структурное состояние ДНК в клетках (41). Коммерческое использование разделенной по полу спермы в зарубежных странах началось с 2000 года и к настоящему времени в мире получено более 2 млн телят (42). В основном разделенную сперму быков используют для осеменения телок. В среднем в дозе содержится не менее 2 млн подвижных сперматозоидов. Предпринимаются попытки улучшить биологическую полноценность разделенной спермы в процессе ее криоконсервации. В частности, изучено защитное влияние на половые клетки быков антиоксидантов пирувата натрия и каталазы, добавление которых в состав синтетической среды улучшало подвижность и живучесть заморожено-оттаянных сперматозоидов (43). Совместное введение в состав среды для разделения сперматозоидов бычьего сывороточного альбумина и антиоксидантов значительно повышало живучесть и оплодотворяющую способность не замороженных половых клеток (44).

Основная трудность использования разделенной спермы в свиноводстве состоит в том, что в дозе должно содержаться большее число сперматозоидов по сравнению с дозой для крупного рогатого скота. Первые поросята от разделенного семени были получены после лапароскопического введения спермы непосредственно в яйцеводы свиней (20). Позднее яйцеклетки свиней оплодотворяли invitro c использованием фракции Х-сперматозоидов (45). Все потомки, родившиеся у свинок после пересадки им таких эмбрионов, оказались самками. В других экспериментах удалось получить потомство мужского пола при внутрицитоплазматическом введении разделенных не замороженных сперматозоидов хряка в яйцеклетки и дальнейшей их активации invitro (46).

С целью уменьшения числа сперматозоидов в дозе для осеменения свиней разработана методика глубокоматочного введения спермы через цервикальный канал с помощью гибкого катетера (47, 48). Оказалось, что для нормальной оплодотворяемости свиней достаточно ввести в верхушку рога матки 50-70 млн разделенных сперматозоидов (49, 50). Кроме того, предлагается вводить семя непосредственно в яйцеводы с помощью лапароскопа (51, 52). Использование этой методики позволило достичь высокой оплодотворяемости при дозе 0,3; 0,5 и 1 млн сперматозоидов. Анализ генетических изменений в лимфоцитах поросят, полученных от разделенного семени, не выявил мутагенного воздействия высокоскоростной проточной цитометрии на половые клетки (53). При двукратном осеменении свиней разделенной заморожено-оттаянной спермой в дозе 160 млн сперматозоидов отмечено значительное увеличение эмбриональной смертности по сравнению с контрольной группой, осемененной не разделенной спермой (54).

В овцеводстве и коневодстве также проводятся исследования эффективности применения разделенной по полу спермы. Австралийские ученые впервые получили потомство от разделенной спермы баранов в 1996 году (55). Овцам пересаживали эмбрионы, полученные invitro, с помощью внутриплазматического введения в яйцеклетки одиночных разделенных сперматозоидов. В 1997 году были проведены успешные эксперименты по искусственному осеменению овец разделенной спермой с использованием лапароскопа (56). Эффективность лапароскопического осеменения овец заморожено-оттаянной разделенной спермой была изучена в специальных опытах (57). Овцам опытных групп внутриматочно вводили 1, 5 и 15 млн заморожено-оттаянных разделенных сперматозоидов, контрольным животным - 50 млн не разделенных сперматозоидов. Оплодотворяемость в опыте составила соответственно 61,5; 66,1 и 66,7 %; в контроле - 63,2 %.

При введении разделенной не замороженной спермы в верхушку рога матки кобылам было получено 87 % потомков желаемого пола (58). По мнению ряда ученых, более перспективный способ осеменения кобыл разделенной спермой - гистероскопическое введение семени непосредственно в верхушку рога матки (59, 60). Более высокой оплодотворяемости кобыл от разделенного семени удалось достичь при введении 20 млн сперматозоидов в маточно-трубное сочленение (61). C использованием этой технологии получено потомство и от криоконсервированной разделенной спермы жеребцов (42).

Таким образом, технология разделения сперматозоидов по полу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии представляет эффективный способ регуляции пола и в настоящее время находит применение в практике разведения не только крупного рогатого скота, но и других видов сельскохозяйственных животных. Дальнейшее совершенствование этой технологии позволит улучшить результативность разделения сперматозоидов и повысить эффективность искусственного осеменения животных.

7. Молекулярные основы наследственности.

- Нуклеиновые кислоты, их строение, функции и генезис.

- Основные этапы биосинтеза белков. Генетический код, его основные свойства.

-Тонкое строение гена. Регуляция экспрессии генов.

Молекулярные основы наследственности.

1. Свойства и биологическая роль нуклеиновых кислот.

2. Строение ДНК и РНК.

3. Репликация ДНК.

4. Виды РНК и их функции.

5. Биосинтез белка, транскрипция и трансляция.

Нуклеиновые кислоты – материальные носители наследственной информации – были открыты в 1869 году ф. Миллером.

Свойства и биологическая роль нуклеиновых кислот заключаются в следующем: ДНК и РНК являются местом сохранения наследственной информации и самовоспроизведения;

Только с прямым участием нуклеиновых кислот может происходить синтез белков; нуклеиновые кислоты являются катализаторами химических реакций; эти кислоты самые длинные и устойчивые к факторам; без этих кислот жизнь организмов невозможна. Нуклеиновые кислоты состоят из остаток фосфорной кислоты, сахара и одного азотистого основания. ДНК размножаются самоудвоением (репликацией).Белки синтезируются в рибосомах с участием и РНК и тРНК( транскрипция и трансляция).

Литература: основная – 1,2,3,4,6; дополнительная – 8,9,14.

Молекулярные основы наследственности и изменчивости

1. Нуклеиновые кислоты, их строение, функции и генезис

2. Основные этапы биосинтеза белков. Генетический код, его основные свойства

3. Регуляция экспрессии генов

1. Нуклеиновые кислоты, их строение и функции .

Материальным носителем наследственности является молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Молекула ДНК состоит из двух нитей, закрученных друг относительно друга. Каждая из цепочек образована отдельными блоками - нуклеотидами, в последовательности которых закодирована генетическая информация. Информация считывается лишь с одной нити, вторая способствует более компактной упаковке огромной молекулы в клетке. Клетка обладает способностью на основе ДНК строить молекулы белков. Генетический код универсален - у всех организмов, от простейших до самых высоко организованных определенная последовательность нуклеотидов "воплощается" в идентичную структуру белка. Функции белков в организме необыкновенно разнообразны, их специфика прямо или опосредованно влияет на любое свойство индивидуума

Cхема строения ДНК

Молекулы ДНК состоит из 4 типов нуклеотидов. Друг от друга они отличаются по азотистому основанию, входящему в их состав: это может быть аденин, гуанин, тимин или цитозин. В двухцепочечной молекуле азотистые основания расположены внутри спирали; они способны образовывать водородные связи друг с другом. В силу молекулярной геометрии двухцепочечный комплекс устойчив, когда напротив аденина одной цепи располагается тимин другой, а напротив гуанина - цитозин. Комплементарность цепей позволяет осуществлять два важнейших процесса. С одной стороны, она делает возможным матричный синтез - построение новой молекулы ДНК на основе уже существующей по образу и подобию материнской. Исходная молекула "расплетается" и новые цепи достраиваются по принципу комплементарности.
С другой стороны, комплементарность лежит в основе транскрипции - важнейшего этапа синтеза белков. Комплементарно к молекуле ДНК строится молекула другой нуклеиновой кислоты - рибонуклеиновой (РНК). В дальнейшем, уже в ходе трансляции, информация, заключенная в РНК, воплощается в структуре белков.
"Словом" в "языке" ДНК является последовательность из трех нуклеотидов - так называемый триплет. Каждому триплету в цепочке ДНК соответствует определенная аминокислота в составе белка.

Нуклеиновые кислоты – это линейные неразветвленные гетерополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды, связанные фосфодиэфирными связями.

Нуклеотиды – это органические вещества, молекулы которых состоят из остатка пентозы (рибозы или дезоксирибозы), к которому ковалентно присоединены остаток фосфорной кислоты и азотистое основание. Азотистые основания в составе нуклеотидов делятся на две группы: пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (цитозин, тимин и урацил). Дезоксирибонуклеотиды включают в свой состав дезоксирибозу и одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц). Рибонуклеотиды включают в свой состав рибозу и одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), урацил (У), цитозин (Ц).

 

В ряде случаев в клетках встречаются и разнообразные производные от перечисленных азотистых оснований – минорные основания, входящие в состав минорных нуклеотидов.

Свободные нуклеотиды и сходные с ними вещества играют важную роль в обмене веществ. Например, НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) служат переносчиками электронов и протонов.

Свободные нуклеотиды способны присоединять еще 1...2 фосфорные группы, образуя макроэргические соединения. Универсальным источником энергии в клетке является АТФ – аденозинтрифосфорная кислота, состоящая из аденина, рибозы и трех остатков фосфорной (пирофосфорной) кислоты. При гидролизе одной концевой пирофосфатной связи выделяется около 30,6 кДж/моль (или 8,4 ккал/моль) свободной энергии, которая может использоваться клеткой. Такая пирофосфатная связь называется макроэргической (высокоэнергетической).

Кроме АТФ существуют и другие макроэргические соединения на основе нуклеотидов:  ГТФ (содержит гуанин; участвует в биосинтезе белков, глюкозы), УТФ (содержит урацил; участвует в синтезе полисахаридов).

Нуклеотиды способны образовывать циклические формы, например, цАМФ, цЦМФ, цГМФ.  Циклические нуклеотиды выполняют роль регуляторов различных физиологических процессов.

Нуклеиновые кислоты

Существует два типа нуклеиновых кислот: ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота). Нуклеиновые кислоты обеспечивают хранение, воспроизведение и реализацию генетической (наследственной) информации. Эта информация отражена (закодирована) в виде нуклеотидных последовательностей. В частности, последовательность нуклеотидов отражает первичную структуру белков (см. ниже). Соответствие между аминокислотами и кодирующими их нуклеотидными последовательностями называется генетическим кодом. Единицей генетического кода ДНК и РНК является триплет – последовательность из трех нуклеотидов.

Нуклеиновые кислоты – это химически активные вещества. Они образуют разнообразные соединения с белками – нуклеопротеиды, или нуклеопротеины.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – это нуклеиновая кислота, мономерами которой являются дезоксирибонуклеотиды. ДНК является первичным носителем наследственной информации. Это означает, что вся информация о структуре, функционировании и развитии отдельных клеток и целостного организма записана в виде нуклеотидных последовательностей ДНК.

Нуклеиновые кислоты были открыты Мишером в 1868 г. Однако лишь в 1924 г. Фёльген доказал, что ДНК является обязательным компонентом хромосом. В 1944 г. Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти установили, что ДНК играет решающую роль в хранении, передаче и реализации наследственной информации.

Существует несколько типов ДНК: А, В, Z, Т–формы. Из них в клетках обычно встречается В–форма – двойная правозакрученная спираль, которая состоит из двух нитей (или цепей), связанных между собой водородными связями. Каждая нить представлена чередующимися остатками дезоксирибозы и фосфорной кислоты, причем, к дезоксирибозе ковалентно присоединяется азотистое основание. При этом азотистые основания двух нитей ДНК направлены друг к другу и за счет образования водородных связей образуют комплементарные пары: А=Т (две водородных связи) и Г≡Ц (три водородных связи). Поэтому нуклеотидные последовательности этих цепей однозначно соответствуют друг другу. Длина витка двойной спирали равна 3,4 нм, расстояние между смежными парами азотистых оснований 0,34 нм, диаметр двойной спирали 1,8 нм.

Длина ДНК измеряется числом нуклеотидных пар (сокращ. – пн). Длина одной молекулы ДНК колеблется от нескольких тысяч пн (сокращ. – тпн) до нескольких миллионов пн (мпн). Например, у наиболее простых вирусов длина ДНК составляет примерно 5 тпн, у наиболее сложных вирусов – свыше 100 тпн, у кишечной палочки ~ 3,8 мпн, у дрожжей ~ 13,5 мпн, у мушки дрозофилы ~ 105 мпн, у человека ~ 2900 мпн (размеры ДНК даны для минимального набора хромосом – гаплоидного). Длину ДНК можно выразить и в обычных метрических единицах длины: общая длина молекулы ДНК у кишечной палочки составляет ~ 1,3 мм, а длина молекулы ДНК в составе первой хромосомы человека ~ 16 см, а длина ДНК во всем геноме человека (в 23 хромосомах) ~ 1 метр. В эукариотических клетках ДНК существует в виде нуклеопротеиновых комплексов, в состав которых входят белки-гистоны.

Аминокислоты. Двадцать аминокислот.

Двадцать аминокислот, из которых обычно построены белки, показаны на рис. 3.6. Аминокислоты соединяются друг с другом с помощью пептидной связи, которые образуются в результате конденсации аминогруппы (NH2) одной аминокислоты с карбоксильной группой (СООН) другой аминокислоты. Последовательность аминокислот в полипептидной цепи записывают от аминокислоты со свободной NH2-гpyппoй до аминокислоты со свободной СООН-группой.

Генетический код

Наиболее неясным в синтезе белков был вопрос о том, как т-РНК находит соответствующий участок м-РНК, к которому должна быть присоединена приносимая ею аминокислота. Это зависит от последовательности нуклеотидов в цепи молекулы и-РНК, причем заранее можно было утверждать, что такого рода генетический код не может состоять из одного или двух нуклеотидов, т.к.последних только четыре, сочетаний из двух нуклеотидов 16, а аминокислот 20. Следовательно, если бы код включал даже по два нуклеотида, то это вызвало бы неизбежную путаницу в синтезе определенной белковой молекулы. Отсюда было высказано предположение, что генетический код должен включать не менее трех нуклеотидов, т.е. должен быть тригшетным.

Кодом наследственности или генетическим кодом называется процесс перевода триплетной последовательности нуклеотидов молекулы ДНК в последовательность аминокислот в белковой молекуле. Одним из важнейших свойств генетического кода является его колинеар-ность — четкое соответствие между последовательностями кодонов нуклеиновых кислот и аминокислотами полипептидных цепей.

Важное значение для раскрытия генетического кода имели исследования М.Ниренберга и ДжМаттеи, а затем С.Очоа с сотрудниками, начатые ими в 1961 г. в США. Они разработали метод и экспериментально установили последовательность нуклеотидов в кодонах м-РНК, контролирующая местоположение данной аминокислоты в полипептидной цепи.

В бесклеточную среду, содержащую все аминокислоты, рибосомы, т-РНК, АТФ и ферменты, Ниренберг и Маттеи вводили искусственно синтезированный биополимер типа м-РНК, представляющий собой цепочку одинаковых нуклеотидов - УУУ-УУУ-УУУ... Биополимер кодировал синтез полипептидной цепи, содержащей только одну аминокислоту -фенилаланин; такая цепь называется полифенилаланином. Если м-РНК состояла из кодонов, содержащих нуклеотиды с азотистым основанием цитозин, то синтезируется полипептидная цепь, содержащая аминокислоту пролин, - полипролин.

В дальнейшем исследователи получали искусственные полимеры типа м-РНК, содержавшие, помимо урацила, одно или два других основания А, Г или Ц в разных пропорциях. Они наблюдали, что в зависимости от второго основания и его соотношения с У получаемые полипептиды включали, помимо фенил аланина, какую-нибудь другую аминокислоту или даже две их. Аналогичное явление наблюдалось и при замене урацила А, Г или Ц. Из 20 аминокислот 18 оказались закодированными одним или двумя основаниями и только две требовали для включения в полипептид три основания. Следовательно, представление о триплетности кода этими опытами было доказано. Для трех нуклеотидов, обусловливающих включение той или иной аминокислоты в молекулу белка, был предложен термин «кодон»-происходящий от слова «код».

Следующим этапом расшифровки генетического кода было изучение последовательности оснований в кодоне. Ведь первыми исследованиями было установлено лишь то, какие основания входят в состав кодона, но, например, при составе кодона 2ГУ основания в нем могут располагаться в последовательности 11 У, ГУТ или УТТ, что будет влиять на включение той или иной аминокислоты.

Большие и тонкие исследования в указанном направлении были проведены Нирнбергом и его сотрудниками; они использовали для этой цели метод, основанный на том, что первая стадия синтеза белка в рибосомах заключается в присоединении т-РНК, несущих ту или иную аминокислоту, к определенному кодону м-РНК. Оказалось, что для такой связи не обязательно нужна целая молекула м-РНК: достаточно использовать состоящие их трех оснований соединения, в котором их последовательность легко точно установить.

В результате этих исследований и работ других ученых, устанавливавших последовательность оснований в кодоне путем изучения мутационных изменений в структурах белков, последовательность оснований в кодонах уже в 1965 г. была выявлена. Из 64 кодонов, возможных при комбинации трех оснований, 61 определяют включение в молекулу полипептида соответствующей аминокислоты, а три определяют конец трансляции (своего рода запятые при синтезе белков). К ним не присоединяется ни одна т-РНК, и в синтезе полипептидной цепи они не участвуют.